高效液相色譜實驗教學改革思考范文

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摘要：

高效液相色譜法是藥物分析的重要方法之一，也是中藥制劑分析課程中一項實踐性很強的教學內容，其中如何更好地使用高效液相色譜儀進行實驗教學，提高學生的自主學習能力以及科研創新能力顯得極為重要。在傳統高效液相色譜課程教學的基礎上，以研究問題為中心，開設綜合性、設計性的實驗，由淺入深的進行了與高效液相色譜相關的實踐教學改革。在激發學生的科研興趣以及提升大型儀器實驗教學的整體質量和水平方面，取得了良好的效果。

關鍵詞：

高效液相色譜；設計性；綜合性；實驗教學

隨著科學技術的突飛猛進和國家經濟建設的快速發展，高效液相色譜作為一種重要的分離分析技術，需求和應用越來越廣泛[1]。國家對高等教育的投入日益增大，高校的辦學規模、教學質量和基礎設施建設都有了明顯的改善和提高[2-5]，同時對實驗設備的經費投入也逐年增加，各高校也相繼添置了大量大型儀器設備，實驗教學和科研條件都有了極大的改善。其中在藥學相關專業中應用最廣、使用頻率最高的是高效液相色譜儀。針對如何充分利用現有儀器，如何有效的提高大學生運用大型儀器進行科學研究的自主創新能力，以及建立系統的、漸進的實踐教學新體系成為當前高校實驗教學的主要目標。高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChro－matography，HPLC)技術始于20世紀60年代末期，是以氣相色譜和經典液相色譜法為基礎的新型分析技術[6]。高效液相色譜具有分辨率高、速度快、分析精準等優點，從而使其在藥物分析研究中對于物質的分離和分析占據越來越重要的作用，成為目前醫藥行業研究中的一種重要分析手段，也是各大高等學校藥學等相關專業藥物分析課程中的一個重點內容。近年來，由于素質教育的提出社會的需求不僅僅看重學生的知識及學習能力等，對學生的實際動手能力更是越來越看重，這使得實驗教學的重視程度提高到了一個新高度，尤其是高效液相色譜儀等大型貴重儀器的理論及實驗教學引起了各高等學校的普遍關注和高度重視[7]。在HPLC的實驗教學方面，許多高校由于設備條件、實驗室經費以及實驗技術人員水平等方面的限制，使HPLC的實驗教學受到較大的影響，只能做簡單的演示實驗，本科生基本沒有個人接觸、操作相應的實驗設備的機會。

為改變這一現象，我校實驗教學中心從實驗設備、人員配備及教學內容與方法等諸多方面對高效液相色譜的實驗傳統教學做了改進。以研究問題為中心，開設相關專業的綜合性的，自主設計性實驗選修課及設計性實驗，不僅能夠讓學生獨立思考、設計實驗以及處理問題，還能夠讓學生真正的操作運用該儀器并熟練的掌握。實踐表明，新的實驗教學方式使得學生能夠全面地了解實驗的內容，使學生能夠根據實驗數據結果對自己的進一步研究做出相對比較合理的判斷與推理，為學生在創新課題的申報及畢業實習打下了良好的基礎。

1高效液相簡介

高效液相色譜法有“三高一廣一快”的特點：①高壓；②高效；③高靈敏度；④應用范圍廣；⑤分析速度快、載液流速快。高效液相色譜法按分離原理可分為離子色譜、吸附色譜、分配色譜、親和色譜、體積排阻色譜[8]。根據兩相極性差異，又可將其分為正相色譜與反相色譜。高效液相色譜法是目前應用最為廣泛的方法，也是藥物分析及實驗教學中最常采用的方法，其中最為常用的是反相高效液相色譜法，即采用極性流動相和非極性固定相對樣品進行分析的方法。高效液相色譜儀主要包括進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統等五大系統。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、預柱或保護柱、柱溫控制器等。

2高效液相色譜實驗在傳統的實驗教學中存在的問題

高效液相色譜法是分析分離混合物最有效的方法，被廣泛應用于各個領域，在醫藥學領域更為看重，占據藥物分析的主導[9]。高效液相色譜相關課程的理論性和實踐性很強。相對于一般的色譜實驗該儀器分析理論性相對較抽象，儀器結構更加復雜，并且在其理論的學習中涉及的相關學科較多。在該儀器的實踐教學方面，首先是目前在實驗教學方面教育教學方法比較單一，具體以教師的傳授-強化-記憶的過程為主的填鴨式的傳統教學，即“以教師為中心”的教師講學生聽。這種教學模式不利于培養適合當今快速發展的科學技術人才，也不能培養具有創新精神和實踐能力的人才，難以保證教學的質量與效率；其次是理論課程的教學與實際實驗的相脫節，儀器分析實驗在諸多高校里的實驗課程多數是以演示型或驗證型實驗為主，從而學生只要按實驗講義的內容按部就班的進行實驗，不必也不會主動的利用理論課堂的知識來完成實驗，其結果是學生動手不動腦，時間一久也就對接觸到的儀器相關知識忘記的一干二凈；再有目前各大高校在實驗教學方面儀器較少，相關儀器的教學課程也相對較少，因此學生接觸的機會也就相對較少。并由于學校的擴招，每個實驗組的學生人數大約二十幾人，造成學生多儀器少的現象，因而不利于每個學生親自動手學習。同時也會使一些較為懶散的學生產生能不做就不做的想法，這樣的儀器分析實驗課則會變成“參觀儀器”；最后因分析儀器的更新在很短的時間內就有很大的突破，而HPLC的使用與功能的開發和科研結果有著非常密切的關系，HPLC的教學體系未能跟上分析儀器的發展，因此HPLC儀器基礎理論教學和實驗教學急待完善、充實、深化與提高[10-12]。

3高效液相色譜實驗在實驗教學中的應用與改革

目前很多高校內都置辦了諸多的大型儀器設備，如高效液相色譜儀這類大型的精密儀器，如何讓學生接觸并且掌握其原理和使用方法，開設實驗課則變成了整個過程的關鍵。但傳統教學中往往是學生按照實驗講義的具體步驟做，只是動手不動腦。如何讓學生完成該從文獻調研、實驗設計、復雜樣品前處理、柱子與流動相的選擇，方法學的考察，結果分析等環節建立完整的儀器的使用與研發，提高學生的科研創新能力是目前各大高校急需解決的一個問題。我校實驗教學部根據現有的設備提出了高效液相色譜實驗的設計內容，針對傳統儀器分析實驗的“實驗技術路線及方案固定、實驗結果已知或固定、規定有限的時間內完成”教學模式。提出以“解決實際問題為中心，開設綜合性、設計性實驗”，從而有效的提高學生運用現代大型儀器進行科學研究的科研創新能力。為了讓同學們充分了解高效液相色譜的相關知識及熟練掌握其操作，我校安排了設計性的實驗，其相關步驟內容如圖1。為了抓好學生操作的規范性，注重實驗過程。實驗過程劃分為四個部分:系統適應性實驗、方法學考察、樣品測定、儀器操作及報告：系統適應性實驗考核的內容是基本的理論參數概念，諸如理論板數、分離度、拖尾因子等，要求學生通過實驗得出的色譜圖，計算出其各內容的相關數值，從而加深對HPLC系統適用性的認識與理解。方法學考察分別從線性范圍試驗、精密度實驗、加樣回收率實驗、穩定性實驗和重復性實驗等方面考核標準曲線方程、相關系數、線性范圍等，這部分實驗經過老師指導分析后開始，由學生以小組為單位討自主設計具體的實驗方案。首先通過對樣品的前處理、配制對照品溶液、按照已設計的線性范圍方案稀釋對照品、樣品經微孔濾膜過濾后進樣、儀器數據處理的峰面積、求出標準曲線方程、相關系數、線性范圍；精密度實驗，該實驗主要考察了學生對精密度概念的理解和掌握；加樣回收率試驗，在老師的指導下由學生自主設計，采用諸多科研文獻的方法設計高、中、低的濃度進行實驗。根據線性范圍確定中間濃度，比如已確定的線性范圍是10~100μg，則其中間濃度設定為50μg，本底值的確定按照《藥典》規定：本底與加入的比例1∶1確定樣品的本底值，再根據線性范圍確定各濃度的加入值；樣品的測定實驗考核的是學生根據數理統計學對數據的處理和計算，已達到對數據處理的規范性與合理性。而儀器操作及報告部分考核的是學生對實驗的預習以及查閱相關的文獻資料，再有就是實驗過程中的記錄和實驗報告部分，規范其記錄的內容和形式，從而強調原始記錄的重要性。通過這四部分考核，要求學生注重實驗的具體操作過程，在實驗中培養學生嚴謹的邏輯思維和使用HPLC儀器的方法。

3.1具體的實驗-HPLC法測定復方丹參滴丸中丹酚酸B的含量

3.1.1實驗目的的確定和方向的選擇目前《中藥制劑分析》實驗課程在高效液相色譜教學中選取的供試品多為原藥材，改革后實驗選取的待測樣品是現代中藥制劑新劑型的成藥制劑復方丹參滴丸，復方丹參滴丸(FufangDanshenDiwan)是根據《中國藥典》2010版一部復方丹參片的處方，在現代高科技條件下提取丹參、三七的有效成分再加入適量冰片而制成的新型純中藥滴丸劑，其藥理作用為活血化瘀，理氣止痛，用于氣滯血瘀所致的胸痛，心前區刺痛，臨床上用于治療胸中憋悶、心絞痛。隨著研究的深入，復方丹參方的物質基礎及作用機制也逐漸明晰，其主要成分是丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R、龍腦、異龍腦等。在2010版《藥典》中對復方丹參片和復方丹參顆粒的含量測定都有關于丹酚酸B的方法，但是對于復方丹參滴丸中相關含量測定卻沒有提到丹酚酸B的測定[13]，現代藥理研究表明丹酚酸B是丹參水溶性物質中活性最強的成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制細胞凋亡等多方面的藥理作用，同時對心、腦、肝、腎等多個器官具有保護作用[14]。因此建立可行的分析方法用于測定復方丹參滴丸中丹酚酸B的含量具有重要的意義，選擇這個實驗用于高效液相相關的實驗教學改革，對我校學生的綜合能力、創新能力和獨立思考能力及交流合作能力的培養都將會有非常大的幫助。

3.1.2實驗方案的確定以及實驗內容的安排在老師的指引下，由學生和老師共同探討確定實驗的方向，提出相關的問題。讓學生帶著問題查閱一定的文獻資料，初步建立實驗方案；接著在老師的監督下以小組為單位進行相互的討論，總結查閱文獻和整理過程中的一些問題，及提出一些自己的見解，在老師的指導下建立初步的實驗方案；隨后讓學生帶著未解決的問題查閱相關資料，進行第二次討論，最后確定最終實驗方案。最后確定的實驗流程見圖2。

3.1.3實驗具體內容

3.1.3.1實驗的前期準備查閱相關文獻資料，設計試驗方法，準備試驗所需儀器與試劑和藥品。Softa單泵液相色譜儀，紫外檢測器；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。復方丹參滴丸（天津天士力公司）；丹酚酸B對照品。

3.1.3.2液相條件的選擇流動相和測定波長的選擇：經查閱文獻參考流動相有以下幾種，甲醇-乙腈-甲酸-水=30∶10∶1∶59、甲醇-0.2%磷酸水溶液=40∶60、乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75；測定參考波長為280nm、283nm、286nm；流速1.0ml/min，柱溫室溫。參考以上條件選擇最佳的流動相和測定波長。最后確定最佳的流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液=25∶75，最佳波長為280nm，柱溫為室溫。

3.1.3.3供試品提取條件的選擇選擇提取溶劑：純甲醇、75%甲醇、50%甲醇、水；提取方法：純加熱回流、超聲處理（功率300w，頻率50khz）；提取時間：20min、30min、40min。對以上條件做正交試驗，選取最佳供試品提取條件為75%甲醇超聲處理，提取時間為30min。

3.1.3.4對照品和供試品溶液的配制準確稱量對照品1mg于10ml容量瓶，用75%甲醇溶解并定容至刻度，配制成0.1mg/ml的對照品溶液；準確稱量0.2g的復方丹參滴丸樣品，于25ml容量品，加大約20ml75%甲醇，密塞，超聲提取30分鐘，放冷，定容得供試品溶液。對照品與供試品的色譜圖見圖3。

3.1.3.5方法學考察a.線性范圍考察：分別用手動進樣器進5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、125μg/ml、250μg/ml的對照品溶液20μl，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，做線性回歸。進樣量在0.050~0.250μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，得到的線性方程為Y=10440X-67963，其R2=0.9999.（n=6）b.精密度試驗：取同一對照品溶液，連續進樣6次，每次20μL，記錄丹酚酸B的峰面積，計算RSD值。最后得丹酚酸B峰面積的RSD值為0.53%。c.重現性試驗：取復方丹參滴丸供試品溶液，連續進樣6次，每次20μl，記錄供試品中丹酚酸B的峰面積，計算RSD值為1.06%。d.穩定性實驗：取供試品溶液，每隔2小時進樣一次，共測定6次，峰面積RSD=0.91%（n=6），結果表明，樣品溶液在12h內穩定，故用于實驗教學是一個較為合理的選擇。e.加樣回收率實驗：準確稱取已知丹酚酸B含量的樣品9份，分別加入高、中、低量的對照品各3份，測定溶液中丹酚酸B的含量，計算回收率。

3.1.3.6樣品含量的測定取復方丹參滴丸樣品溶液3份，平行測定其含量，求取平均值，最后得復方丹參滴丸中丹酚酸B的含量為0.36%。

3.1.4實驗結果匯總實驗完成后，老師組織參與實驗的同學進行實驗匯報，總結交流心得，并以PPT、實驗報告等形式上交實驗結果，同時記錄在整個實驗過程出現的問題、心得以及體會，規范實驗記錄的內容和形式，強調原始記錄的重要性。通過對實驗結果的總結和分析，培養學生嚴謹的邏輯思維以及分析問題、解決問題的能力。

4結語

以研究問題為中心，開設綜合性、設計型實驗，提高本科生的科研創新自主學習能力。結合高效液相色譜實驗，教會學生“提出問題→分析問題→解決問題”的系統學習方法，培養學生系統全面的分析解決問題的能力；培養相關專業學生的使用高效液相色譜儀的實踐動手操作能力，使學生在進入實習后可以獨立操作高效液相色譜儀；通過總結分析實驗結果，提高學生的分析問題及解決問題的能力，并且定期在全校范圍內開展與高效液相色譜儀的相關匯報與學習交流，形成濃厚的學術交流氣氛。通過本項實驗教學改革，使得高效液相色譜儀在我校能夠物盡其用，充分發揮我校培養高素質、高技能人才的作用，提升我校畢業學生的就業競爭力。

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作者：宋麗麗 王建勝 劉紅玥 張玉萍 崔廣智 莊朋偉 單位：天津中醫藥大學實驗教學部 天津中醫藥大學中藥學院