慢病毒下的胃癌細胞論文范文

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1材料與方法

1.1方法

1.1.1STAT3-shRNA慢病毒表達載體的構建選擇GenBank提供的STAT3基因序列（NM_139276.2）為靶基因，委托上海紐恩公司設計多個RNA干擾靶點序列，結合設計軟件評估測定結果及公司設計經驗，最終確定并合成shRNA序列：5’-AACTTCAGACCCGTCAACAAA-3’，進一步合成雙鏈DNAoligo，退火后與AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切載體pLKD.CMV.G&PR.U6.shRNA連接，轉化細菌感受態細胞，對長出的克隆進行PCR鑒定，測序比對正確后，抽提重組質粒，與包裝質粒psPAX2、外膜質粒pMD2.G共轉染293T細胞完成病毒組裝。離心去除細胞碎片并用0.45μmPESfilterflask過濾收集上清液，100000×g，4℃超速離心2h后得到濃縮的STAT3-shRNA病毒液。同法構建陰性對照病毒。進一步梯度感染293T細胞，熒光顯微鏡下計算綠色熒光蛋白（greenflu－orescentprotein，GFP）數目，計算病毒滴度。測得干擾病毒滴度為：3.80×108Tu/ml，陰性對照病毒滴度為：6.51×108Tu/ml。

1.1.2細胞培養用含10％小牛血清、1％的青/鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基于37℃，5％CO2的培養箱中培養SGC-7901細胞，每3天按1∶3的比例傳代。

1.1.3慢病毒轉染SGC-7901細胞實驗共分為3組：實驗組（STAT3-shRNA轉染組）、陰性對照組（空病毒載體轉染組）、空白對照組（正常SGC-7901細胞）。SGC-7901細胞按1×106個/孔均勻接種至6孔板，長至匯合度為30％～40％時，加入慢病毒（感染復數MOI=20），12h后更換為新鮮的無病毒培養基。

1.1.4激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）各組細胞按2×103個/孔均勻接種至裝有滅菌爬片的24孔板中，48h后棄培養基，PBS溶液洗3次，4%多聚甲醛固定10min，輕輕取出爬片并倒扣于載玻片上，甘油封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.1.5Real-timePCR檢測STAT3基因表達收集各組細胞1×106個，trizol法抽提總RNA，紫外分光光度計測RNA純度及濃度后逆轉錄為cDNA，反應條件為：42℃60min，95℃5min，5℃5min。取2μlcDNA模板進行PCR。STAT3上游引物序列為：5’-GAGGACTGAGCATCGAGCA-3’，下游引物序列：5’-CATGTGATCTGACACCTGAA-3’，擴增產物長85bp；內參引物β-actin上游序列為：5’-CTGGAACGGTGAAGGT－GACA-3’，下游引物序列：5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATG－CA-3’，擴增產物長140bp。PCR反應條件：95℃30s，95℃5s及60℃30s共循環40次。每個樣本設3個復孔，采用2-ΔΔCt公式比較mRNA相對表達水平，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.1.6Westernblot檢測STAT3、Bcl-2、survivin及Mcl-1蛋白表達收集各組細胞，裂解緩沖液（裂解液∶蛋白酶抑制劑混合物=500∶2）冰上裂解15～20min，4℃、12000r/min離心15min以分離細胞碎片。BCA蛋白定量法測蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸至完全變性。50μg總蛋白提取物在10％SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉至PVDF膜（90V，1.5h）。室溫下用含5％脫脂奶粉的TBST溶液孵育1h以阻斷非特異性結合，一抗（STAT3稀釋比例為1∶2000，Bcl-2、survivin及Mcl-1稀釋比例為1：200）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次×5min；二抗（1∶2500）37℃孵育2h，TBST洗膜3次×5min，最后用ECL化學發光法顯影。應用QuantityOne軟件分析圖像，蛋白相對表達強度用目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.1.7MTT法分析5-Fu的化療敏感性將細胞均勻接種至96孔板（5×103個/孔），貼壁后加入5-Fu至終濃度分別為0、5、10、15、20、50、100μg/ml，每個濃度設3個復孔。48h后每孔加20μl5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h，棄培養基，每孔加150mlDMSO溶液。搖床上震蕩15min，用酶標儀測定570nm處吸光度值（absorbance，A）。以不加5-Fu組作對照，計算各組細胞的增殖抑制率，公式為：增殖抑制率（100％）=[對照組A570nm－實驗組A570nm]/對照組A570nm×100%。

1.1.8流式細胞儀比較細胞凋亡差異細胞接種至6孔板，貼壁后加入5-Fu至終濃度為20μg/ml。48h后，收集4×105個細胞，PBS洗滌2遍后用195μlAnnexinV-PE結合緩沖液重懸細胞，加入5μlAnnexinV-PE（帶紅色熒光），混勻后室溫下避光孵育10min，離心棄上清，加入200μl結合緩沖液，盡快送流式細胞儀檢測。

1.2統計學處理實驗均重復3次，使用統計分析軟件SPSS17.0處理數據，用均數±標準差（x±s）表示數據，以單因素方差分析法比較多組間差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1GFP在SGC-7901細胞中的表達慢病毒感染SGC-7901細胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到細胞生長狀態良好，可見實驗組及陰性對照組均有明顯GFP表達（圖1）。

2.2STAT3-shRNA轉染后STAT3mRNA及蛋白表達情況Real-timePCR結果（表1）所示，阻斷STAT3信號后，STAT3mRNA相對表達水平下降為0.46±0.04，明顯低于空白對照組1.00±0.01、陰性對照組0.93±0.05（P<0.05）。免疫印跡結果（圖2、表1）顯示，STAT3蛋白相對表達強度在空白對照組、陰性對照組及實驗組中依次為0.78±0.07、0.75±0.05、0.47±0.04，表明STAT3-shRNA可明顯下調STAT3蛋白活性（P<0.05），而陰性對照組和空白對照組之間無明顯差異（P=0.528）。

2.3抑制STAT3表達后SGC-7901細胞對5-Fu的敏感性MTT結果（表2）示，與陰性對照組及空白對照組相比，實驗組細胞增殖抑制率明顯升高（P<0.05），表明STAT3-shRNA能抑制細胞增殖，增強細胞對5-Fu的化療敏感性。

2.4慢病毒介導shRNA抑制STAT3后細胞凋亡率的變化抑制STAT3后細胞凋亡率（39.16±2.25）％，較陰性對照組（23.43±2.86）％、空白對照組（23.75±1.23）％明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），表明抑制STAT3表達能增強5-Fu的凋亡誘導作用（表3）。

2.5STAT3信號通路阻斷后抗凋亡蛋白表達情況Westernblot結果表明（圖3、表4），Bcl-2、Mcl-1及sur－vivin的蛋白表達水平在實驗組中分別為0.47±0.03、0.35±0.02、0.45±0.02，空白對照組中為0.81±0.06、0.52±0.05、0.71±0.03，陰性對照組為0.78±0.07、0.49±0.01、0.67±0.05。與陰性對照組相比，實驗組上述蛋白水平分別下調約40％、29％、33％（P<0.05），而兩對照組之間無統計學差異（P>0.05）。

3討論

5-Fu是胃癌化療的一線藥物，其通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶影響DNA的生物合成，屬于抗代謝類化療藥物，然而其療效往往因癌細胞獲得多藥耐藥性（multidrugresistance，MDR）而受到極大影響[4]。MDR的形成機制十分復雜，耐藥蛋白過表達、細胞凋亡異常、轉錄因子活化、藥物代謝異常等皆可誘導MDR。研究證明，化療藥物發揮細胞毒性作用的主要機制是誘導凋亡，可由于腫瘤細胞內在的抗凋亡程序激活，使得其對化療藥物耐受，最終導致化療失敗[5]。STAT3作為絡氨酸信號通路中的重要轉錄因子，通過調控多個下游靶分子介導細胞的增殖、分化及凋亡。在正常細胞中，STAT3的活化快速而短暫，而在腫瘤細胞中STAT3卻能異常的持續活化，促進細胞不斷增殖，抑制凋亡，誘導腫瘤血管生成及免疫逃逸，最終促進腫瘤發生與發展。Bcl-2、Mcl-1、survivin均是STAT3通路下游的靶基因，其中Bcl-2及Mcl-1是Bcl-2家族蛋白的主要成員，依賴線粒體途徑抑制促凋亡因子的釋放，抑制細胞凋亡[6]；survivin則是凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成員，主要依賴Caspase途徑抑制細胞色素C釋放從而抑制凋亡[7]。近來的研究認為，STAT3的異常活化與腫瘤細胞耐藥有關，抑制STAT3可逆轉細胞的化療抵抗性。Liu等和Gu等[9]分別在黑色素瘤及頭頸部鱗癌中發現，耐藥細胞中STAT3表達水平較不耐藥細胞明顯上調，沉默STAT3可抑制腫瘤生長，逆轉耐藥細胞的化療抵抗性。Duan等[10]發現，轉染IL-6（STAT3的活性配體）可誘導卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥，利用siRNA沉默STAT3可增強紫杉醇的抗腫瘤活性。目前，STAT3沉默對胃癌細胞化療敏感性影響的研究相對甚少，鑒于此，本實驗擬阻斷胃癌SGC-7901細胞的STAT3信號通路，觀察5-Fu化療敏感性的變化。

RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術是利用體外合成的RNA序列特異性地結合并降解同源目的mRNA，使目的基因功能完全或部分喪失的生物學過程，可通過2種途徑實現：一種是直接向細胞轉染小干擾RNA（siRNA），另一種則是通過質粒、病毒或細菌載體將短發夾RNA（shRNA）傳遞至靶細胞[11]。siRNA由于存在易被血清核糖核酸酶降解、穩定性差、轉運效率差等不足之處，因此本實驗選擇更加特異、穩定的shRNA以抑制靶基因表達。本研究通過構建靶向STAT3基因的慢病毒載體，介導shRNA轉染SGC-7901細胞，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到明顯的GFP表達，real-timePCR及免疫印跡結果表明干擾后STAT3mRNA表達抑制率約為54％，蛋白水平下降達40％，說明STAT3在基因及蛋白水平均得到有效抑制。MTT及流式細胞儀檢測發現STAT3-shRNA可增強5-Fu的增殖抑制及凋亡誘導作用，提示SGC-7901細胞對5-Fu的化療敏感性升高。為了闡明其化療增敏的機制，進一步檢測了STAT3下游靶分子Bcl-2、Mcl-1、survivin蛋白的表達，發現三者的活性均明顯下調，這與Liu[12]、Wen等[13]的實驗結果一致，說明STAT3-shRNA能通過抑制STAT3表達進而下調該通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1、survivin的活性，誘導腫瘤細胞凋亡，使5-Fu的抗腫瘤活性增強。

總之，慢病毒介導的STAT3-shRNA能靶向抑制SGC-7901細胞中STAT3基因表達，通過阻斷STAT3信號通路使下游的抗凋亡信號Bcl-2、Mcl-1、survivin的表達下降，促進細胞凋亡，在一定程度上提高胃癌細胞對5-Fu的化療敏感性。本實驗結果表明，靶向STAT3的基因治療聯合化療，能逆轉胃癌細胞對5-Fu的抵抗性，有可能成為胃癌治療的有效新途徑。但本實驗僅為初步的體外實驗，腫瘤細胞的耐藥是涉及多種機制的復雜過程，尚需進一步開展動物實驗驗證。

作者：鐘竹周偉吳小翎單位：重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科重慶市腫瘤醫院放療科