胃腺癌細胞論文范文

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1材料與方法

1．1方法

1．1．1細胞培養人胃癌細胞SGC-7901細胞株和SGC-7901/DDP培養于RPMI-1640培養液(90%)和胎牛血清(10%)、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的混合培養基中，在5%CO2、37℃的溫箱培養。SGC-7901/DDP在無藥物培養基連續培育7d，然后將順鉑(終濃度800ng/ml)添加到SGC-7901/DDP的RPMI-1640培養基。2～3d進行一次消化傳代，使細胞處于對數生長期。

1．1．2彗星實驗(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)取處于對數生長期的SGC-7901和SGC-7901/DDP細胞，以0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640培養基制備成濃度為1×105個/ml單細胞懸液，臺盼藍染色細胞存活率＞90%進行SCGE。取110μl已熔化的0.5%正常熔點瓊脂糖澆注到全磨砂載玻片上，4℃固化10min后，依次加入10μl細胞懸液與75μl0.5%低熔點瓊脂糖的混合液，4℃固化10min，固化后的玻片沉浸在細胞裂解液中，4℃避光裂解1h。PBS清洗載玻片后用堿性電泳液浸沒載玻片4℃避光解旋DNA20min。將電泳儀電壓維持25V，電流維持在0.3A，恒壓恒流4℃電泳25min，注意避光操作。然后用中和緩沖液(pH7.4)漂洗，用甲醇固定，滴加30μl濃度為20μg/ml的EB染液進行染色。400倍熒光顯微鏡下紫外光激發顯像，隨機轉動視野拍攝30個細胞的SCGE檢測圖像，實驗獨立重復3次［2］。

1．1．3細胞形態學觀察通過倒置顯微鏡下觀察SGC-7901和SGC-7901/DDP形態的不同，拍照記錄。

1．1．4細胞劃痕實驗取狀態良好的人胃腺癌細胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP，胰蛋白酶消化，5×106個/ml制備接種到24孔板，5%CO2、37℃的溫箱培養，細胞長成單層后丟棄介質，用滅菌槍頭借助無菌尺在每孔的底部中間劃一個“十”字傷口，用PBS輕輕清洗3遍，洗去懸浮的細胞，每孔加入2ml的無血清的RPMI-1640培養基培養，分別于0、12、24h在交叉處拍照，利用Imageproplus軟件測量劃痕的間距，細胞劃痕遷移率(%)=(0h劃痕的間距－不同時間點的劃痕間距)/0h劃痕的間距×100%，每次實驗做3個復孔，實驗獨立重復3次。

1．1．5MTT法檢測藥物的敏感性取狀態良好的人胃癌SGC-7901和SGC-7901/DDP，將濃度為7×104個/ml的細胞加入到96孔板中，每孔100μl體積，過夜培育。當達到80%～90%細胞密度，加化療藥物干預，并設置不同濃度(以上每組3個平行孔)48h，同時設置調零孔和無藥物孔。順鉑(0.03、0.3、3、30、60μg/ml)、5-氟尿嘧啶(0.1、1、10、100、200μg/ml)、依托泊苷(5、10、20、40、80μg/ml)、表阿霉素(0.01、0.1、1、10、100μg/ml)、多西紫杉醇(5、10、20、40、80μg/ml)、奧沙利鉑(5、50、100、200、400μg/ml)。在實驗孔加入MTT(5mg/ml)20μl，37℃培育4h，注意避光操作。結束培育，將上清液完全吸去，各孔加入DMSO150μl，振蕩15min，使結晶充分溶解。用酶聯免疫吸附法在570nm波長檢測各孔光密度值(opticaldensity，OD)，求3孔的平均值，實驗獨立重復3次。細胞存活率(%)=(實驗組OD平均值/對照組的OD平均值)×100%，同時計算出各類藥物的半數抑制率(halfmaximalinhibitoryconcentrationofasubstance，IC50)，細胞對不同藥物的耐藥倍數=SGC-7901/DDP對不同化療藥物的IC50/SGC-7901對化療藥物的IC50。

1．2統計學處理采用SPSS19．0統計軟件分析。數據以珋x±s表示，單變量兩組之間的比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2．1人胃腺癌細胞株SGC-7901和SGC-7901/DDP的DNA損傷修復能力的差異SCGE的結果是利用CASP軟件分析尾長作為DNA損傷與修復的評價指標。人胃腺癌細胞SGC-7901和SGC-7901/DDP的彗星尾長分別為29.71±4.45和20.38±3.48(t=16.67，P＜0.05)，見圖1、2。

2．2細胞形態人胃腺癌SGC-7901細胞顯微鏡下觀察為單層、形狀規則、大小均勻、高折射率、細胞邊界、核大、圓形或橢圓形;人胃癌SGC-7901/DDP細胞呈不規則、細胞大小不均一、多核、折光度低，見圖3。

2．3細胞劃痕實驗用顯微鏡測量人胃腺癌SGC-7901和SGC-7901/DDP在0、12、24h細胞劃痕的寬度，結果顯示:SGC-7901細胞12、24h劃痕寬度比SGC-7901/DDP細胞劃痕寬度明顯縮小(F=77.12，P＜0.05)，SGC-7901的遷移能力比SGC-7901/DDP的遷移能力強，見圖4、5。

2．4胃腺癌SGC-7901/DDP對各類化療藥的敏感性人胃腺癌細胞SGC-7901和SGC-7901/DDP對不同藥物的敏感性，順鉑、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、依托泊苷、多西紫杉醇對順鉑耐藥株及其親本細胞SGC-7901的IC50和耐藥倍數見表1，SGC-7901/DDP對順鉑耐藥的同時對表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷、奧沙利鉑也具有不同程度的耐藥。

3討論

目前已有大量的實驗致力于對順鉑耐藥性的研究，其中DNA的損傷修復作用引起廣泛關注，核苷酸切除修復(nucleotideexcisionrepair，NER)是DNA修復的重要途徑，核苷酸切除修復交叉互補基因1(excisionrepaircross-complementinggene1，ER-CC1)蛋白是順鉑誘導NER中的關鍵酶，ERCC1是可以識別DNA損傷和斷開鏈間交聯的功能，研究表明，ERCC1mRNA和蛋白的過表達使DNA修復能力的增強與臨床胃癌患者順鉑化療療效呈負相關性。然而，目前對NER能力的檢測多用于臨床胃癌組織，無法反映腫瘤的生物學行為發生變化所導致的NER的變化，有學者提出外周血淋巴系統與腫瘤細胞攜帶有同源基因，均具有相同的NER系統。

本研究以人胃腺癌SGC-7901及其順鉑耐藥株SGC-7901/DDP作為研究對象，用SCGE的方法檢測在人胃腺癌SGC-7901細胞株和其順鉑耐藥株SGC-7901/DDP的DNA修復能力，結果顯示人胃腺癌SGC-7901/DDP較其親本細胞的DNA修復能力強;此結果表明腫瘤細胞的DNA的修復能力與對順鉑的敏感性呈負相關，與臨床研究結果一致。同時本研究在表明人胃腺癌SGC-7901順鉑耐藥后其DNA修復能力增強的基礎上，用MTT的方法檢測SGC-7901順鉑耐藥株對其他化療藥物的敏感性是否發生變化，結果顯示SGC-7901/DDP對順鉑耐藥的同時對表阿霉素、5氟尿嘧啶、依托泊苷等也具有不同程度的耐藥，可能由于表阿霉素、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、多西紫杉醇均通過與DNA作用而發揮細胞毒性，由于胃癌順鉑耐藥細胞株的DNA修復能力增強，一定程度抑制其發揮細胞毒性作用，并且有研究表明，腫瘤細胞內順鉑積累的減少，是腫瘤細胞產生耐藥的重要原因，多藥耐藥基因1是編碼P糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白(multi-drugresist-ance-associatedprotein，MRP)的基因，P糖蛋白是一種跨膜蛋白，其通過ATP供能，將藥物泵出細胞;MRP也是一種能量依賴的運輸蛋白，其主要是識別與谷胱甘肽形成MRP-1-ATP，自動把藥物從細胞內轉移到細胞外，從而讓細胞內藥物濃度降低，藥物抵制腫瘤的影響削弱甚至消失，使細胞獲得耐藥性。本研究通過細胞劃痕實驗顯示SGC-7901/DDP的遷移能力較正常的胃癌細胞株SGC-7901減弱，可能是順鉑進入細胞后形成穩定的Pt-DNA加合物，并且順鉑與金屬硫蛋白的穩定結合使細胞黏附穩定、不易軟化、較正常細胞株不易轉移。

作者：黃娜娜張逸寅顧康生單位：安徽醫科大學第一附屬醫院腫瘤科