抑制劑對胃癌細胞增殖的影響范文

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【摘要】

目的探討Notch2和MEK／ERK信號通路在胃癌細胞SGC－7901中是否存在交叉作用。方法采用體外化學合成的特異性針對Notch2的siRNA（Notch2siRNA）和絲裂原激活蛋白激酶（MEK）／細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路的抑制劑PD98059，分別單獨和聯合處理體外培養的胃癌SGC－7901細胞，以轉染陰性對照siRNA（controlsiRNA）細胞作為siRNA對照組，并設不給予任何轉染的空白對照組。免疫印跡（WesternBlotting）法檢測磷酸化ERK1／2（p－ERK）1／2和Notch2蛋白的表達水平。比色法（MTT）檢測癌細胞增殖抑制率。結果Notch2siRNA能降低蛋白Notch2的表達水平，并抑制癌細胞增殖［（38．26±1．82）％］，而p－ERK的表達水平則較對照組增加。PD98059能降低p－ERK的表達水平，并抑制癌細胞的增殖［（30．05±3．16）％］，Notch2水平則無明顯變化，聯合應用Notch2siRNA和PD98059能明顯降低p－ERK和Notch2蛋白的表達水平，與Notch2siRNA或PD98059單獨應用比較，顯著抑制癌細胞增殖率，差異有統計學意義［（72．55±5．30）％，P＜0．01］。結論特異性抑制Notch2信號通路，且抑制MEK／ERK通路可進一步增強抑制Notch2通路的抗腫瘤增殖效果，提示MEK／ERK和Notch22條信號通路在胃癌SGC－7901細胞中存在交叉作用。

【關鍵詞】

Notch2；MEK／ERK；抑制劑；信號通路；交叉作用

胃癌在我國乃至世界范圍內均為常見的惡性腫瘤之一，其發病率與病死率在我國有上升趨勢［1］。目前，我國胃癌的整體診治水平仍不高，針對腫瘤細胞生長、凋亡等分子生物靶點提出的分子靶向治療逐漸成為胃癌綜合治療的重點和熱點［2］。有研究表明，Notch信號通路的活性紊亂與多種腫瘤（如胃癌）的形成有關，阻滯Notch信號通路將有望成為腫瘤治療的新策略［3－4］。Notch基因通過編碼跨膜受體而誘發多級生物級聯反應，從而參與如細胞增殖、凋亡、周期轉變、分化、血管生成、細胞侵襲、細胞遷移、上皮細胞－間充質轉化（EMT）等細胞生物學過程［3－5］。絲裂原激活蛋白激酶（MEK）／細胞外信號調節激酶（ERK）在多種癌細胞中呈高表達，ERK的活化位于MEK超家族信號轉導過程中的下游，主要負責由MEK始動的生物信息轉導，處于這一通路的中心環節［6］。有研究發現Notch和ERK通路存在相互作用，共同參與細胞分子生物學行為［7］。本實驗通過單獨或聯合阻滯這2個信號通路，探討其在胃癌細胞系SGC－7901中的作用及影響。報道如下。

1材料與方法

1．1一般材料（1）細胞：胃癌SGC－7901細胞系由臺州學院腫瘤研究所細胞培養實驗室傳代保存。（2）試劑：RPMI－1640培養基購自美國GIBCO生物技術公司；ERK1／2抗體、磷酸化ERK1／2抗體、Notch2抗體、GAPDH抗體及相關二抗試劑盒均購自美國的CST公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、PD98059和二甲基亞砜（DMSO）購自美國的Sigma公司；Notch2siR－NA及陰性對照siRNA（ControlsiRNA）購自美國的SantaCruz公司；提取總蛋白試劑盒及WesternBlotting所需的其他試劑來源于碧云天生物技術有限公司。

1．2方法

1．2．1細胞培養和siRNA轉染胃癌SGC－7901細胞置入含10％小牛血清的RPMI－1640培養液中。6％CO2濃度、37℃培養。1×107／L細胞接種于細胞培養板（MTT使用96孔板，其他實驗采用6孔板）。根據說明書建議，將siRNA濃度稀釋為50nmol／L，應用脂質體轉染法轉染siRNA。siRNA轉染實驗分為3組，Notch2siRNA干預組、陰性對照siRNA組、空白對照組。

1．2．2比色法（MTT）檢測細胞增殖采用含10％胎小牛血清的培養液將貼壁細胞配成單個細胞懸液，濃度為10000～20000／mL，每孔體積200μL細胞接種到96孔板，細胞貼壁后即加處理因素，每種處理設5個復孔。使用酶聯免疫檢測儀測定490nm處的吸光度（A值），按照公式計算細胞增殖抑制率（CI）／％＝1－（處理組平均A值／空白組平均A值）×100％，并繪制直方圖，實驗重復3次。1．2．3免疫印跡法（WesternBlotting）檢測收集各組細胞，提取總蛋白，將樣品置于100g／L不連續SDS聚丙烯酰胺凝膠加樣孔中，初始電壓為80V，當溴酚藍前沿進入分離膠后，電壓提高至120V，繼續電泳直至分離膠底部。電轉移至硝酸纖維素膜，封閉，與Notch2抗體、ERK1／2抗體或磷酸化的ERK1／2抗體4℃孵育，過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫搖晃1h，顯色，放射自顯影。顯影信號的強弱用密度分析值反映ERK1／2、磷酸化的ERK1／2、Notch2水平（以GAPDH蛋白為內參對照）。

1．3統計學處理采用SPSS18．0統計軟件進行數據分析，計量資料組間比較使用配對t檢驗，多組間比較應用方差分析，計數資料采用等級相關檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1胃癌SGC－7901細胞的Notch2阻滯導致ERK1／2活化使用脂質體轉染法將Notch2siRNA載體瞬間轉染人胃癌SGC－7901細胞，轉染48h后WesternBlot驗證Notch2siRNA干擾SGC－7901細胞中活化的Notch2蛋白（ICN2）表達，活化的Notch2表達顯著下調，即出現Notch2通路阻滯，并伴隨磷酸化的ERK1／2表達增加，致使ERK1／2活化，提示ERK1／2活化與Notch2下調有關。見圖1。

2．2聯合應用Notch2siRNA和PD98059對Notch2和p－ERK1／2的表達水平的影響Notch2siRNA轉染能顯著降低蛋白Notch2的表達水平，而p－ERK1／2的表達水平則較對照組增加；MEK／ERK通路的抑制劑PD98059能降低p－ERK1／2的表達水平，Notch2水平則無明顯變化；Notch2siRNA和PD98059聯合應用后，p－ERK1／2和Notch2蛋白的表達水平均降低。見圖2。

2．3Notch2siRNA和PD98059聯合應用對SGC－7901細胞增殖的影響Notch2siRNA和PD98059均能抑制胃癌SGC－7901細胞增殖，其細胞增殖抑制率分別為（38．26±1．82）％和（30．05±3．16）％，且Notch2siRNA和PD98059聯合應用癌細胞的增殖率降低更明顯，其細胞增殖抑制率為（72．55±5．30）％，顯著高于Notch2siRNA和PD98059單獨處理，差異有統計學意義（P＜0．01）。見圖3。

3討論

Notch通路家族包括4個受體（Notch－1、2、3、4）和5種配體（jagged－1，jagged－2，Delta樣受體1、3、4）［3－5，8］。細胞Notch受體與鄰近細胞Notch配體結合后，Notch通路即被激活［8］。激活的Notch蛋白在金屬蛋白酶腫瘤壞死因子－α轉化酶（TA－CE）和γ－分泌酶復合物（γ－secretasecomplex）的蛋白水解下，釋放其細胞內部分ICN，當ICN進入細胞核后活化Notch－CSL復合物，則進一步調控多個下游靶基因的表達［9］。如果采用特異性針對Notch2的siRNA下調Notch2表達則能阻斷上述過程。

MEK／ERK通路在多種癌細胞中呈高表達，ERK的活化位于MEK超家族信號轉導過程中的下游，主要負責由MEK始動的生物信息轉導，處于這一通路的中心環節。使用特異性抑制劑降低其下游磷酸化ERK的水平，從而阻斷ERK的磷酸化活化及其下游信號級聯反應，從而阻斷MEK通路的生物學效應［10］。本組的前期工作發現，非選擇性Notch通路阻滯劑DAPT（一種γ分泌酶抑制劑）未能誘導胃癌細胞明顯凋亡，卻激活ERK1／2通路［11］。當然，DAPT對Notch通路家族（Notch1～4）均可能有阻滯作用，具體是哪個Notch通路家族成員的阻滯而導致ERK1／2活化，以及ERK1／2活化對該Notch通路阻滯的抗腫瘤作用的影響及機制尚不清楚。由于維持癌細胞生存的信號轉導過程是由一個復雜的網絡系統完成，對癌細胞某單一生存信號通路的阻滯常導致其他的生存信號通路的激活，從而使癌細胞有可能逃脫針對單一通路的治療作用［12］。

本研究結果表明，Notch2siRNA能抑制癌細胞的增殖，降低蛋白Notch2的表達水平，而Notch2siRNA也能增加p－ERK1／2的表達水平。PD98059能降低p－ERK1／2的表達水平，并抑制癌細胞的增殖，但對Notch2表達水平則無明顯變化。與單獨使用Notch2siRNA或PD98059比較，聯合使用Notch2siRNA和PD98059阻滯這2種信號通路后，能更顯著地降低p－ERK1／2和Notch2蛋白的表達水及胃癌細胞的增殖率。提示Notch2信號通路被抑制后ERK1／2通路活性被某種程度地上調，在此基礎上應用MEK／ERK通路抑制劑PD98059，從而抑制ERK1／2通路，使得2條通路均被抑制，則胃癌細胞的增殖抑制率更明顯。由此本組設想，Notch2通路的阻滯可能會導致胃癌細胞中其他生存信號通路（如ERK1／2通路）的活化，從而使胃癌細胞有可能逃脫針對Notch2通路的靶向治療作用。然而，該作用在不同分化程度的胃癌細胞中是否具有普遍性，以及Notch2阻滯誘導的ERK1／2活化對胃癌細胞惡性生物學行為的具體作用及其機制，則有待于通過本項目的深入研究。

作者：劉富強 陳依依 岳婷婷 葉蓓 錢翠娟 姚軍 單位：臺州學院椒江校區醫學院醫學檢驗教研室 浙江省臺州市立醫院消化內科