涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞來(lái)源微泡研究范文

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［摘要］

目的：通過檢測(cè)涎腺腺樣囊性癌來(lái)源微泡量與神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)量的關(guān)系，為進(jìn)一步探求涎腺腺樣囊性癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散及嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制提供分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：用掃描電鏡觀察微泡分泌量的情況。采用超高速密度梯度離心法分離純化微泡，以WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)其標(biāo)志性蛋白的表達(dá)。結(jié)果：神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)和ACC－2微泡的分泌呈正相關(guān)性。從ACC－2培養(yǎng)上清中分離出的小泡，透射電鏡下觀察為直徑50－100nm、大小均一、具有明顯異質(zhì)性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，有完整的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)；WesternBlot檢測(cè)出小泡中含有HSP70和MHC－Ⅰ的表達(dá)。結(jié)論：涎腺腺樣囊性癌來(lái)源微泡可能在其嗜神經(jīng)侵襲中起著重要作用，且與神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］

微泡；腺樣囊性癌；透射電鏡；掃描電鏡

微泡在免疫學(xué)領(lǐng)域、尤其腫瘤免疫治療方面逐漸成為研究熱點(diǎn)[1]。微泡是直徑30～100nm的雙層脂質(zhì)膜包被的扁圓球形小泡，體內(nèi)多種細(xì)胞都能分泌，其生物膜上和內(nèi)容物中含有大量與其來(lái)源和功能密切相關(guān)的蛋白、核酸、脂質(zhì)成分[2]。微泡可從多種體液中分離提取[3]，參與各種生理和病理過程[4]。目前有多種正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞來(lái)源微泡的報(bào)道[5～8]。但對(duì)涎腺腺樣囊 性癌細(xì)胞來(lái)源的微泡尚未見報(bào)道。涎腺腺樣囊性癌（salivaryadenoidcysticcarcino－ma，SACC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，在涎腺惡性腫瘤中居第2位[9]。其局部侵襲性強(qiáng)，易沿神經(jīng)鞘膜及組織間隙擴(kuò)散，邊界不清；易侵入血管，發(fā)生血運(yùn)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率31．66％，是口腔領(lǐng)面部惡性腫瘤中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率最高的腫瘤之一[10]。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)NTs及其受體在腺樣囊性癌、前列腺癌、胰腺癌等具有嗜神經(jīng)侵襲特性腫瘤中呈現(xiàn)特異性高表達(dá)，證實(shí)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族及其受體與腫瘤嗜神經(jīng)侵襲關(guān)系密切[11]。還有報(bào)道神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nervegrowthfactor，NGF）及其受體是腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲機(jī)制的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一[12]。此外，研究表明，表達(dá)特異性表面受體分子的細(xì)胞能分泌更多微泡[6]。由此推測(cè)，在培養(yǎng)體系中添加某些相關(guān)刺激因子可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的微泡分泌。而微泡可能為探索涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病機(jī)理及臨床診斷、治療提供新的思路。故本研究通過探測(cè)不同表達(dá)量的生長(zhǎng)因子及微泡分泌量的關(guān)系，為進(jìn)一步探求涎腺腺樣囊性癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散及嗜神經(jīng)侵襲的機(jī)制提供分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、材料和方法

1材料DMEM培養(yǎng)基（ThermoScientificHyclone，美國(guó)）；胎牛血清（上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司）；NGF－7S（神經(jīng)生長(zhǎng)因子）、K252a（TrkA阻斷劑）、重水、分析純蔗糖（Sigma－Aldrich，美國(guó)）；鼠抗人MHC－I單克隆抗體、鼠抗人HSP－70單克隆抗體（Santa，美國(guó)）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG結(jié)合物（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；超高速冷凍離心機(jī)（Beckman，美國(guó)）、掃描電子顯微鏡S3400＋EDX（Hitachi，日本）；100kDaAmi－con超濾離心管（Millipore，美國(guó)）；透射電子顯微鏡（Hitachi，日本）；凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP，美國(guó)）；細(xì)胞株：人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC－2及ACC－M，人舌癌細(xì)胞系Tca8113，人皮膚惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375（上述細(xì)胞株均由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。2細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇細(xì)胞ACC－2、ACC－M、Tca8113、A375，棄去上清液，加入lmL培養(yǎng)基重懸，接種至75mm2培養(yǎng)瓶中，加入8mL培養(yǎng)基，放入37℃的CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，按常規(guī)隔日換液，3d傳代1次。待傳代3次開始后續(xù)試驗(yàn)，收集更換的上清液，以備提取微泡用。3掃描電鏡樣品制備：4種細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別用0．25％胰酶消化收集，并作細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度1×105個(gè)／mL，接種50μL細(xì)胞懸液到6孔培養(yǎng)板中央（內(nèi)置蓋玻片），放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h。孵育畢，倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始貼壁，遂加入2mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。次日，按如下分組更換培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。（根據(jù)產(chǎn)品說明書確定最終工作濃度，NGF－7S：10ng／mL，K252a：100nM。）對(duì)照組仍加入DMEM培養(yǎng)液NGF組更換的DMEM培養(yǎng)液中加入NGF－7S使其最終濃度為10ng／mL阻斷組吸除原培養(yǎng)液后，PBS5mL洗2次，加入工作濃度為100nM的K252a1mL，37℃孵育45min，吸除，PBS5mL洗2次，換為DMEM培養(yǎng)液于24h后吸除培養(yǎng)液，PBS液輕洗2次，取出細(xì)胞爬片，2．5％戊二醛（0．lmol／LPBSpH＝7．4配制）4℃固定24h。送電鏡中心處理。脫水（用30％～100％濃度梯度乙醇逐級(jí)脫水）、臨界點(diǎn)干燥、真空噴金。掃描電鏡下觀察、照相。4微泡提取：按照GMP（GoodManufacturingPractice）標(biāo)準(zhǔn)[16]提取制備微泡樣品（ACC－2MV），用0．22μm濾器過濾除菌，分裝，置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?鑒定微泡5．1用透射電鏡觀察提取的ACC－2MV。采用負(fù)染法處理電鏡樣品，取20μLACC－2MV樣品于載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1min；用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20g／L磷鎢酸（pH＝6．8）約30μL于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1min；用濾紙吸干負(fù)染液，在白熾燈下烤干，于透射電鏡下觀察、照相。5．2用WesternBlotting法檢測(cè)微泡標(biāo)志性蛋白HSP－70和MHC－I在ACC－2MV中的表達(dá)。將微泡樣品ACC－2MV和ACC－2細(xì)胞裂解物用SDS－PAGE凝膠分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉后分別用鼠抗人HSP70、MHC－I單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。6數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均為3次WesternBlot獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以x±s表示。采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用ANOVA和t檢驗(yàn)，取P＜0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

二、結(jié)果

1掃描電鏡結(jié)果掃描電鏡下，細(xì)胞表面附著多少不等的圓形、大小較均一的小泡。在對(duì)照組，4種細(xì)胞的微泡分泌均只在個(gè)別、少數(shù)細(xì)胞中觀察到，且細(xì)胞表面附著的微泡數(shù)目較少；在NGF組，觀察到A375、ACC－2、ACC－M細(xì)胞中有微泡分泌細(xì)胞數(shù)明顯增多，且每個(gè)細(xì)胞微泡附著量也增多，但Tca8113細(xì)胞中有分泌細(xì)胞數(shù)增加不明顯；在阻斷組，4種細(xì)胞微泡分泌均顯著減少，鏡下幾乎看不到有微泡附著的細(xì)胞（圖1）。2微泡的鑒定2．1形態(tài)學(xué)觀察：將ACC－2培養(yǎng)上清中分離出的沉淀，置于透射電鏡下觀察，可見大小均一、具有明顯異質(zhì)性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，染色后可見囊泡中央色淡、周邊濃染，邊緣清晰。直徑50～100nm，有完整的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)（圖2）。2．2WesternBlotting法檢測(cè)微泡標(biāo)志性蛋白HSP－70和MHC－I的表達(dá)（以beta－actin蛋白為內(nèi)參）經(jīng)免疫印跡分析，本實(shí)驗(yàn)從ACC－2培養(yǎng)上清中提取的微泡ACC－2MV中明顯檢測(cè)到了微泡標(biāo)志性蛋白HSP－70和MHC－I的表達(dá)（圖3）。UVP分析儀測(cè)得各蛋白條帶的灰度值（表1），以目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白相對(duì)含量。結(jié)果顯示，和等量的ACC－2細(xì)胞裂解物相比，ACC－2微泡ACC－2MV內(nèi)的HSP－70和MHC－I蛋白含量偏少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）（表2）。

三、討論

研究發(fā)現(xiàn)腺樣囊性癌細(xì)胞表達(dá)NGF、NT－3及相應(yīng)受體TrkA、TrkC與嗜神經(jīng)侵襲相關(guān)，而且對(duì)ACC嗜神經(jīng)侵襲起促進(jìn)作用，而在其它無(wú)嗜神經(jīng)性的惡性腫瘤及多形性腺瘤中均無(wú)表達(dá)。有研究報(bào)道，ACC病理切片中神經(jīng)束的密度明顯高于正常腮腺組織及腺泡細(xì)胞癌，認(rèn)為ACC分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子刺激神經(jīng)纖維向ACC腫瘤細(xì)胞群內(nèi)生長(zhǎng)。故神經(jīng)生長(zhǎng)因子及相應(yīng)受體，可作為ACC的生物學(xué)標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子NT－3可通過TkrC加強(qiáng)雪旺細(xì)胞遷移能力，而這一作用可被特異性酪氨酸激酶受體阻斷劑K252a所阻斷。在本實(shí)驗(yàn)中，研究對(duì)象惡性黑色素瘤（A375）、腺樣囊性癌（ACC－2、ACC－M）均是有嗜神經(jīng)侵襲特性的腫瘤，而舌癌（Tca8113）不具備這一特性。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)惡性黑色素瘤細(xì)胞、腺樣囊性癌細(xì)胞、舌癌細(xì)胞均可見微泡分泌，其中腺樣囊性癌細(xì)胞、舌癌細(xì)胞只有個(gè)別細(xì)胞分泌微泡，但惡性黑色素瘤細(xì)胞有較多細(xì)胞分泌且每個(gè)細(xì)胞附著的微泡數(shù)也較多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤和ACC細(xì)胞的微泡分泌量受神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的影響，能顯著增加；且神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體阻斷劑（K252a）能有效抑制微泡的分泌，間接說明微泡分泌的增加是受NGF影響。而舌癌細(xì)胞的微泡分泌不太受神經(jīng)生長(zhǎng)因子影響，也間接說明神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)嗜神經(jīng)性腫瘤的作用。由此可假設(shè)，腺樣囊性癌周圍的神經(jīng)組織能分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其他相關(guān)因子，作用于腫瘤細(xì)胞后，其微泡能大量分泌，進(jìn)而由微泡攜帶腫瘤細(xì)胞的相關(guān)信息物質(zhì)與神經(jīng)組織互相作用。

目前已知微泡可由多種類型細(xì)胞分泌，包括血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。在透射電鏡下可觀察到微泡的特征性形態(tài)－－碟狀外形，即由脂質(zhì)雙分子層包被的扁圓球形。直徑約30～100nm，密度在1．13～1．19g／mL之間。傳統(tǒng)的微泡提取方法多是超高速差速離心和超濾離心法。而我實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)證明通過蔗糖密度梯度離心法提取微泡的量及純度均較佳。目前對(duì)微泡的鑒定主要依賴形態(tài)學(xué)觀察和蛋白組成分析。用透射電鏡觀察微泡形態(tài)，用WB鑒定特異性蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到直徑50～100nm，大小均一、具有明顯異質(zhì)性的圓形或橢圓形膜性小囊泡，在形態(tài)學(xué)上與已有報(bào)道的微泡特征相符，而與以往研究所呈現(xiàn)出來(lái)的差異，考慮是由于實(shí)驗(yàn)中電鏡樣本制備方法之間的差異引起的。此外，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的2種微泡標(biāo)志性蛋白（MHC－I及HSP－70）均有良好表達(dá)，且微泡內(nèi)的這兩種蛋白含量較細(xì)胞內(nèi)少，其差異性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見，本實(shí)驗(yàn)通過差速離心法及重水蔗糖墊法成功分離提取到了涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞分泌的微泡。綜上所述，對(duì)涎腺腺樣囊性癌來(lái)源微泡進(jìn)行的初步研究，將為涎腺腺樣囊性癌發(fā)病機(jī)制的研究以及涎腺腺樣囊性癌的臨床治療提供一個(gè)新的契機(jī)。

作者：張卓遠(yuǎn) 嚴(yán)超然 李博 李龍江 單位：四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科·口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室