順鉑聯合姜黃素誘導胃癌細胞凋亡研究范文

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摘要

目的：研究應用順鉑聯合姜黃素對誘導胃癌細胞HGC27凋亡的影響及機制。方法：用CCK8法檢測單獨或聯合使用不同劑量順鉑或/和姜黃素對胃癌細胞HGC27增殖的影響；用Hochest33258染色檢測聯合應用順鉑和姜黃素誘導胃癌細胞HGC27凋亡的發生率。用Westernblot檢測細胞凋亡相關分子PARP1蛋白剪切體和DNA損傷蛋白p-γH2AX的表達變化。結果：單用順鉑可以呈劑量依賴性地促進HGC27細胞凋亡。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖無明顯作用，10μmol•L-1姜黃素反而輕微促進HGC27細胞增殖。20、40、80μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞的增殖抑制率分別為10.97%、15.15%、32.93%。分析聯合用藥組：5μmol•L-1姜黃素聯合順鉑組反而促進HGC27細胞生長；10μmol•L-1姜黃素聯合不同劑量順鉑和單用順鉑組比較，組間抑制率沒有統計學差異（P>0.05）。20μmol•L-1姜黃素聯合4、6μmol•L-1順鉑有明顯的促進細胞的凋亡作用,抑制率分別為70.68%、87.30%。Hochest33258染色結果顯示，聯合用藥組細胞凋亡小體和壞死細胞明顯增多。Westernblot結果顯示，在聯合用藥組HGC27細胞PARP1剪切體蛋白和p-γH2AX蛋白表達明顯增加。結論：順鉑聯合姜黃素可以促進胃癌細胞HGC27的凋亡，機制是姜黃素可以加重順鉑引起的細胞DNA雙鏈損傷。

關鍵詞

順鉑；姜黃素；細胞凋亡；p-γH2AX

自從Rosenberg等[1]發現順鉑的抗腫瘤活性后，鉑類藥物的研究得到迅速發展。鉑類藥物已被廣泛應用于各種惡性腫瘤的臨床治療中。據統計，目前臨床化療或者聯合化療治療惡性腫瘤的方案中有70%~80%應用到鉑類藥物。由于鉑類藥物在治療過程中伴發嚴重的胃腸反應、腎毒性、耳毒性、神經毒性和耐藥性等[2]，因此，如何減弱該類藥物的毒副作用和增加其化療敏感性日益受到關注。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種植物多酚。姜黃素的抗腫瘤作用為多靶點，因而日益引起重視。姜黃素對消化系統、生殖系統的多種腫瘤等均具有一定程度的抑制作用[3]。化療藥物增敏方面，聯合使用順鉑和姜黃素已用于肝癌[4]、肺癌[5]、卵巢癌[6]等研究。目前，對于順鉑聯合姜黃素是否可以直接通過引起DNA雙鏈損傷的加重而誘導胃癌HGC27細胞凋亡尚未見報道。本實驗通過聯合用藥直接觀察雙鏈損傷的指標p-γH2AX和凋亡相關標志物PARP1蛋白剪切體的變化，初步探討這兩種藥物聯合作用誘導胃癌細胞HGC27凋亡的作用機制。

1材料

1.1細胞來源及培養人胃癌細胞HGC27購自中國科學院上海細胞生物研究所。細胞培養于含100μg•mL-1鏈霉素、100U•mL-1青霉素和10%胎牛血清的RMPI1640培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.2試藥與儀器RMPI1640培養基（Invitrogen，美國）；胎牛血清（四季青，杭州）；青霉素（山東新華魯抗，批號20141007）；鏈霉素（華北制藥，批號F31121126）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業股份有限公司，諾欣TM，批號140302）；姜黃素（Turmeric，原植物Curcumalon-ga，Sigma公司）；BCA（BicinchoninicAcidproteinsaykit）蛋白濃度測定試劑盒、熒光染料Hochest33258試劑盒、RIPA裂解液[50mmol•L-1Tris（pH7.4），150mmol•L-1NaCl，1%TritonX-100，0.1%十二烷基磺酸鈉，1%去氧膽酸鈉]；裂液、單克隆抗α-tubulin抗體、抗熒光淬滅劑（南通碧云天生物技術有限公司）；CCK-8（CellCountingKit-8）試劑盒（上海同仁化學有限公司）；抗PARP1抗體、抗p-γH2AX抗體（美國Abcam公司）；增強化學發光液（Enhancedchemi-luminescence，ECL，美國Millipore公司）；其它生化試劑均為國產分析純。CO2恒溫培養箱（美國Thermo公司）；IX-70倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；垂直電泳儀；半干式電轉移裝置（美國Bio-Rad公司）；酶聯免疫檢測儀（美國Bio-TEKInstruments公司）。

2方法

2.1CCK-8法檢測順鉑和姜黃素抑制胃癌細胞HGC27增殖培養HGC27細胞：在96孔板中每孔接種5000個細胞。對細胞進行分組處理：單用順鉑組（0、2、4、6、8μmol•L-1）、單用姜黃素組（0、5、10、20、40、80μmol•L-1）、順鉑聯合姜黃素組，即2、4、6、8μmol•L-1順鉑分別聯合5、10、20μmol•L-1姜黃素，以上各組處理細胞24h，每孔加入CCK-8試劑10μL，37℃繼續培養1.5h，在酶標儀上450nm檢測吸光度A450nm。每組設3平行實驗。計算藥物（或藥物組合）對細胞增殖的抑制率。

2.2Hochest33258染色法檢測順鉑聯合姜黃素誘導胃癌細胞HGC27凋亡在6孔板中接種HGC27細胞，待細胞培養至80%滿6孔板孔底。分別設4組：對照組、單用4μmol•L-1順鉑組、單用20μmol•L-1姜黃素組、4μmol•L-1順鉑聯合20μmol•L-1姜黃素用藥組。處理HGC27細胞24h，去培養液，用甲醇室溫固定30min。每孔加入Hochest33258染色液50μL。避光染色30min后，應用磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗滌3遍，加入抗熒光淬滅劑20μL，立即在熒光顯微鏡下觀察細胞中凋亡小體的情況。

2.3免疫印跡法檢測HGC27細胞凋亡相關分子的變化在培養的HGC27細胞，按照“2.2”方法分別設立對照組和處理組，處理細胞24h。用RIPA裂解液裂解細胞，4℃、12000r•min-1離心10min，取上清液，運用BCA法測定蛋白濃度。灌制12.5%分離膠的SDS-PAGE。分別按照60μg/孔的上樣量，加入全蛋白，經90V穩壓電泳后，運用200mA恒流半干式電轉移1h，5%脫脂奶粉室溫封閉膜1h，PBST液洗滌3次，孵育抗體按照α-tubulin（1∶1000）、PARP1（1∶1000）；p-γH2AX（1∶500）稀釋，4℃孵育過夜，PBST液洗滌；加入1∶1000稀釋的辣根過氧化酶（HRP）標記二抗，37℃孵育1h，PBST液洗滌。ECL化學發光液曝光、檢測。進行灰度值比較（相對灰度值=處理組灰度值/對照組）。

2.4統計學處理運用SPSS16.0統計軟件包進行分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間樣本均數間采用多因數方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3結果

3.1順鉑和姜黃素對HGC27細胞增殖的抑制作用

3.1.1順鉑和姜黃素單獨作用結果預實驗分別考察4種不同濃度順鉑和5種不同濃度姜黃素組對HGC27細胞的抑制作用，由表1可見，2、4、6、8μmol•L-1順鉑可以呈劑量依賴性的抑制細胞增殖。5μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖無明顯影響；10μmol•L-1姜黃素對HGC27細胞增殖反而略有促進作用；20、40、80μmol•L-1姜黃素可以不同程度地抑制HGC27細胞增殖。其中20、40μmol•L-1姜黃素組間沒有差異；80μmol•L-1姜黃素有明顯抑制HGC27細胞增殖的作用（見表1）。

3.1.2順鉑聯合姜黃素對HGC27細胞增殖的影響聯合用藥結果（見表2）顯示：2、4、6μmol•L-1順鉑和5μmol•L-1的姜黃素聯合應用對HGC27細胞增殖的抑制率分別為17.64%、36.90%、66.29%。單用2、4、6μmol•L-1順鉑對HGC27細胞抑制率分別是34.09%、46.18%、71.55%。提示5μmol•L-1的姜黃素和順鉑聯用反而抑制腫瘤細胞的凋亡。2、4、6、8μmol•L-1順鉑聯合10μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導HGC27細胞凋亡率分別為32.32%、49.00%、72.80%、86.21%，與單用順鉑組細胞凋亡率34.09%、46.18%、71.55%、86.21%相接近，兩組間抑制率沒有統計學差異（P>0.05）。當4、6μmol•L-1的順鉑聯合20μmol•L-1的姜黃素作用時，誘導細胞凋亡率為70.68%、87.30%，顯著高于單用順鉑的凋亡率，P<0.05，差異具有統計學意義（見表2）。

3.2順鉑聯合姜黃素對HGC27細胞凋亡的影響聯合用藥作用于HGC27細胞24h后，經Hochest33258染色，并計數500個細胞中凋亡細胞的個數，折算凋亡率（每組3平行）。結果顯示，單用順鉑可以引起細胞凋亡（圖1-B），其凋亡率為23.2%；20μmol•L-1姜黃素可以誘導少量細胞凋亡（圖1-C），凋亡率為5.71%；聯合應用順鉑和姜黃素作用于HGC27細胞組發生的凋亡最明顯（圖1-D），其凋亡率為35.60%，顯著高于單用順鉑組和單用姜黃素處理組（圖2）（P<0.05）。

3.3免疫印跡法檢測HGC27細胞在凋亡過程中相關因子的變化運用Westernblot法檢測單用4μmol•L-1順鉑、單用20μmol•L-1姜黃素和順鉑聯合姜黃素作用24h，HGC27細胞內DNA雙鏈損傷分子標志物p-γH2AX和凋亡蛋白PARP1剪切體的表達水平。結果顯示，單用4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素均可以引起p-γH2AX表達增加，其相對灰度值分別為：6.70和3.7；聯合用藥組p-γH2AX表達增加最明顯，其相對灰度值為8.52。單用順鉑和姜黃素也可以誘導HGC27細胞中PARP1蛋白的剪切體表達，其相對灰度值分別為5.32和3.27。聯合用藥組中，細胞內PARP1蛋白的剪切體表達增加最明顯，其相對灰度值為6.27。與單用順鉑組比較，聯合用藥組p-γH2AX和PARP1剪切體均顯著增加（P<0.05），提示姜黃素可促進順鉑誘導的HGC27細胞DNA損傷和凋亡（圖3、圖4）。

4討論

我國胃癌的發病率占所有惡性腫瘤的第四位，死亡率占第二位。作為一線化療藥物，順鉑被廣泛用于胃癌等實體瘤治療中。順鉑主要通過主動運輸形式進入細胞，與DNA嘌呤形成鏈內交聯或鏈間交聯，導致DNA雙鏈損傷，引發細胞凋亡[7]，DNA損傷可激活PARP1蛋白，從而殺傷腫瘤細胞[7]。但是，應用順鉑治療的同時會引發多種副作用和產生藥物耐藥性。如何降低鉑類藥物的耐藥性，增加機體藥物敏感性，愈來愈受到人們重視。將中藥提取單體姜黃素聯合順鉑用于誘導HGC27細胞DNA損傷和凋亡，結果顯示，順鉑可以濃度依賴性誘導胃癌細胞凋亡；而姜黃素只有當濃度達20μmol•L-1時才有誘導HGC27細胞凋亡的作用。所以，最終選擇4μmol•L-1順鉑和20μmol•L-1姜黃素用于觀察其聯合作用，其抑制率是單用4μmol•L-1順鉑的1.53倍，明顯提高HGC27增殖抑制和誘導凋亡的效果。DNA雙鏈損傷的早期反應是使組蛋白γH2AX蛋白的羧基末端磷酸化，γH2AX蛋白磷酸化的升高，激活凋亡相關蛋白PARP1的剪切體的表達，可顯著增加癌細胞對順鉑等化療藥物的敏感性[8]。磷酸化γH2AX蛋白是DNA雙鏈損傷的效應器，其變化可反映DNA雙鏈損傷的程度[9]。本研究顯示，4μmol•L-1順鉑聯合20μmol•L-1的姜黃素可以引起磷酸化γH2AX表達明顯上升，PARP1蛋白剪切體表達增加；聯合用藥誘導HGC27細胞的凋亡也相應增加。本研究結果為如何降低順鉑毒副作用、提高順鉑化療藥物的敏感性提供了新的思路。

順鉑聯合姜黃素作用于HGC27細胞，可以增強順鉑誘導細胞凋亡的作用。姜黃素增強順鉑殺傷HGC27細胞作用的原因可能是姜黃素增強了順鉑和DNA的結合能力，從而抑制DNA修復功能[10]，使腫瘤細胞DNA損傷加重，促進細胞的凋亡。本文對順鉑聯合姜黃素促進胃癌細胞凋亡作用進行了初步研究。姜黃素是否能增加其它化療藥物效果或用于逆轉順鉑耐藥細胞的敏感性和減少化療藥物毒副作用等值得深入研究。

參考文獻

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作者：李愛萍 王強 陳敏娟 周建偉 單位：南京醫科大學公共衛生學院