可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖范文

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摘要：目的探討HERC4對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其分子機制。方法設(shè)計特異HERC4siRNA干擾序列，Lipofectamine2000法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染特異siRNA后Hela細(xì)胞HERC4蛋白的表達(dá)水平；CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞的增殖能力；AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞凋亡率的變化；劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞遷移能力。Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2表達(dá)變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染特異siRNA后Hela細(xì)胞HERC4蛋白表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與對照組相比，干擾組Hela細(xì)胞生長速度明顯減慢，細(xì)胞凋亡率增加，遷移能力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。轉(zhuǎn)染后CyclinD1和Bcl-2在蛋白水平的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。結(jié)論siRNA可有效降低宮頸癌Hela細(xì)胞中HERC4的表達(dá)，并通過抑制CyclinD1表達(dá)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖和遷移能力，抑制Bcl-2表達(dá)增加細(xì)胞凋亡能力。

關(guān)鍵詞：HERC4；siRNA；Hela細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌為女性第3大惡性腫瘤，且85%的新發(fā)及死亡病例均出現(xiàn)在發(fā)展中國家。近20年來，我國宮頸癌發(fā)病率和死亡率均明顯上升，且發(fā)病呈年輕化趨勢。預(yù)測宮頸癌的增殖、遷移能力，對了解病變的生物學(xué)特點、選擇正確的治療方案及預(yù)后判斷有著重要的意義。

宮頸癌的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素長期相互作用的結(jié)果，是涉及多基因改變和多階段致癌的復(fù)雜過程，國內(nèi)外已有包括HPV癌蛋白E6、E7，染色體微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定蛋白MCM-5、細(xì)胞周期蛋白CDC6、p16INK4A、鱗狀細(xì)胞癌抗原SCC、細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物如PCNA以及Ki-67等宮頸癌腫瘤標(biāo)志物用于科研及臨床領(lǐng)域，對于提高疾病篩查率及臨床早期診斷具有非常重要的意義。

目前，研究發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasomesystem,UPS）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。E3泛素連接酶通過參與底物識別和底物與泛素連接的作用，在蛋白酶體降解蛋白的底物特異性中起到?jīng)Q定性的作用。HERC4是近年來發(fā)現(xiàn)的E3泛素連接酶，有研究報道其在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)的癌旁正常乳腺組織，且降低HERC4表達(dá)可對乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的增殖產(chǎn)生抑制作用，將細(xì)胞阻滯在G1期。肺癌組織中HERC4的表達(dá)與乳腺癌的研究結(jié)果相同，而HERC4在宮頸癌中的表達(dá)情況及其功能研究在國內(nèi)外尚無公開報道。本研究通過沉默宮頸癌Hela細(xì)胞中HERC4的表達(dá)，進(jìn)一步檢測Hela細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力的變化，從細(xì)胞水平闡明HERC4對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，RIPA裂解液、BCA（BicinchoninicAcid）蛋白定量試劑盒、ECL（Electro-Chemi-Luminescence）化學(xué)發(fā)光液均購自碧云天生物有限公司，兔抗人HERC4，CyclinD1，Bcl-2多克隆抗體購自PLlaboratories，鼠抗人β-actin單克隆抗體購自欣博盛生物科技有限公司，si-RNA由銳博生物有限公司合成，CCK-8試劑，AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidiumiodide,PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，PVDF（polyvinylidenefluoride）膜購自美國Millipore公司。

1.2細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌Hela細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所惠贈。Hela細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3HERC4RNA干擾序列的設(shè)計

根據(jù)NCBI提供的序列（Genebank:XM_011539593）設(shè)計RNA干擾序列，經(jīng)過BLAST分析，排除與其他基因同源的靶序列，共得到3條靶序列（表1），陰性對照siRNA序列為銳博公司專有。

1.4Lipofectamine2000法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞

取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞濃度為5×105個/孔。每個孔加入約500μL無抗生素的培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時，參照Lipofectamine2000說明書的方法將各組siRNA分別轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，終濃度達(dá)到100nmol，同時以未轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞作為空白對照組（未加siRNA及轉(zhuǎn)染試劑），非特異性siRNA作為陰性對照組（NC組），每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.5Westernblotting檢測轉(zhuǎn)染siRNA后Hela細(xì)胞HERC4，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染72h后的各組Hela細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；取蛋白質(zhì)40μg/孔進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉反應(yīng)2h，分別加入抗人HERC4，CyclinD1和Bcl-2的兔源多克隆抗體（1∶1000，3%BSA）或抗人β-actin的鼠源單克隆抗體（1∶2000，3%BSA）于4℃孵育過夜；次日，TBST洗膜3次，每次5min后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗，體積稀釋比例為1∶5000），室溫反應(yīng)1h；TBST洗膜后，用ECL試劑進(jìn)行顯影。使用CareStreamHealth公司的ImageStation4000RPRO成像儀檢測發(fā)光信號。

1.6CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染siRNA后Hela細(xì)胞的增殖能力

將轉(zhuǎn)染24h后的各組Hela細(xì)胞按照5×103個/孔分別接種于96孔板中，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別在細(xì)胞培養(yǎng)0，24，48和72h后加入CCK-8（10μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)1h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450nm波長處各孔的吸光度（A）值。以時間（T）為橫軸，以光吸收值（A）為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染siRNA后Hela細(xì)胞凋亡的變化

將轉(zhuǎn)染72h后的各組Hela細(xì)胞以0.25%的胰蛋白••233酶（不含EDTA）消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入500μLBindingBuffer懸浮細(xì)胞，再加入5μLAnnexinⅤ-FITC混勻，最后加入5μLPI混勻；室溫避光反應(yīng)10min后，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.8細(xì)胞劃痕

實驗取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化后在6孔板中接種1×105個細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在單層細(xì)胞上，用10μL的槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕，用PBS清洗掉懸浮的細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；分別在劃痕的0、12、24、48h給細(xì)胞更換新鮮的不含血清的DMEM培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細(xì)胞從劃痕處向中央爬行的面積，其面積大小表示細(xì)胞遷移能力強弱，拍攝后應(yīng)用圖像分析軟件Image-J軟件計算細(xì)胞遷移面積，遷移面積（48h）=空白面積（0h）-空白面積（48h）。Migrationindex=遷移面積（48h）/空白面積（0h）。3次獨立實驗計算平均值。

作者：危敏1，張艷玲2，陳嵐1，蔡翠霞3，王涵多4單位：1.南山區(qū)婦幼保健院，2.廣州軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基因工程研究所

1.9統(tǒng)計分析

以SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對t檢驗，P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HERC4-si-3轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)Hela細(xì)胞中HERC4蛋白的表達(dá)應(yīng)用Westernblotting分別檢測轉(zhuǎn)染HERC4-si-1、HERC4-si-2、HERC4-si-3組、陰性對照組和未轉(zhuǎn)染的空白對照組Hela細(xì)胞HERC4蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染HERC4-si-3組細(xì)胞HERC4蛋白表達(dá)顯著低于陰性對照組和空白對照組（P<0.01）。這一結(jié)果表明，HERC4-si-3轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)Hela細(xì)胞中HERC4蛋白的表達(dá)水平。

2.2HERC4表達(dá)下調(diào)可顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖

采用CCK-8法檢測HERC4-si-3轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組Hela細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，HERC4-si-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的A值顯著低于陰性對照組和空白對照組細(xì)胞（P<0.01）。這一結(jié)果表明，下調(diào)HERC4的表達(dá)水平可顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖。

2.3HERC4表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡

采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測HERC4-si-3轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組Hela細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，HERC4-si-3轉(zhuǎn)染組Hela細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均高于陰性對照組和空白對照組細(xì)胞（P<0.01）。這一結(jié)果表明，下調(diào)HERC4的表達(dá)水平可促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡。

2.4HERC4表達(dá)下調(diào)可抑制Hela細(xì)胞的遷移

對轉(zhuǎn)染24h后的各實驗組及對照組細(xì)胞進(jìn)行“一”劃痕，劃痕后的0h和48h在顯微鏡下拍照，劃痕區(qū)域的愈合情況可反映細(xì)胞的相對遷移能力。相較于陰性對照組和空白對照組，抑制HERC4表達(dá)后，Hela細(xì)胞的遷移能力明顯降低（P<0.01）；NC組與Mock組相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。

2.5HERC4表達(dá)下調(diào)可抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)

應(yīng)用Westernblot分別檢測轉(zhuǎn)染HERC4-si-3組、陰性對照組和未轉(zhuǎn)染的空白對照組Hela細(xì)胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，下調(diào)HERC4后細(xì)胞CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低。

3討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在其癌變、增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等一系列過程中伴隨著癌基因或抑癌基因變異，引起相關(guān)因子表達(dá)的紊亂，針對這些生物學(xué)特性，RNA干擾技術(shù)已成功應(yīng)用于宮頸癌的基因治療與研究。通過載體攜帶化學(xué)合成的siRNAs，可通過細(xì)胞內(nèi)RNAi體系使靶mRNA（如Bcl-2，cdk-2，mdm-2，pkc-α，tgf-β，H-ras，vegf和GFP的mRNA）沉默，組合不同的siRNAs可有效抑制癌細(xì)胞的增殖和生長。在宮頸癌中最新的研究發(fā)現(xiàn)針對HPVE6/E7癌基因的siRNA可顯著增加小鼠宮頸癌放療的效果；體內(nèi)外研究表明通過全身給藥的方式靜脈輸入siRNA可抑制HPV相關(guān)宮頸癌細(xì)胞E6/E7癌基因的表達(dá)，并激活抑癌蛋白P53從而抑制腫瘤生長速度。

現(xiàn)有的研究證實UPS系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生中可起到關(guān)鍵作用，其成員不僅可以作為潛在的癌癥診斷標(biāo)志物或者預(yù)后指標(biāo)，而且可以作為潛在的分子治療靶標(biāo)。該系統(tǒng)中的E3泛素連接酶因具有特異性而受到廣泛關(guān)注。HERC4是近年來才被鑒定出的一種E3泛素連接酶，其特點是具有HECT結(jié)構(gòu)域和至少一個RCC1樣結(jié)構(gòu)域。免疫熒光結(jié)果顯示HERC4定位于細(xì)胞的核內(nèi)體和溶酶體中。HERC4在各種組織中廣泛表達(dá)，尤其在睪丸組織中大量表達(dá)，研究表明其在小鼠精子成熟過程中發(fā)揮重要作用。HERC4在不同乳腺腫瘤組織中（良性纖維瘤、導(dǎo)管內(nèi)癌、浸潤性導(dǎo)管癌）的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)的癌旁正常乳腺組織，且HERC4的表達(dá)水平越高，乳腺癌的惡性程度越高。在肺癌中的研究結(jié)果表明HERC4在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌、肺鱗狀上皮癌、肺腺癌中的表達(dá)水平均高于對應(yīng)的癌旁正常肺組織，并且HERC4蛋白的表達(dá)情況與肺癌TNM分期、病理組織學(xué)分級相關(guān)。

但HERC4宮頸癌中的表達(dá)情況及其功能研究在國內(nèi)外尚無研究報道，本研究通過轉(zhuǎn)染針對HERC4設(shè)計的特異siRNA，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HERC4-si-3后，Hela細(xì)胞中HERC4蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組。隨后，通過CCK-8法、細(xì)胞劃痕實驗和AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HERC4的表達(dá)水平可顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)Hela細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。以上研究表明HERC4在宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移中起著重要作用。

為了初步探討干擾HERC4表達(dá)對Hela細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響機制，siRNA干擾下調(diào)HERC4水平后細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和Bcl-2的表達(dá)具有重要意義。CyclinD1作用于細(xì)胞周期的G1期，可與多種蛋白相互作用促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖。CyclinD1的過度表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、組織學(xué)類型、分化程度、侵襲性及患者預(yù)后存在密切關(guān)系。而定位于線粒體膜上的Bcl-2為公認(rèn)的Bcl-2家族蛋白成員中主要抗凋亡分子。Bcl-2通過干擾細(xì)胞色素C及鈣離子的釋放，降低核酸內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C無法達(dá)到激活下游胱冬肽酶的閾值，從而保護(hù)細(xì)胞器功能，抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)在Hela細(xì)胞中下調(diào)HERC4的表達(dá)，細(xì)胞周期素CyclinD1和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)均明顯下降，進(jìn)一步說明HERC4在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能通過促進(jìn)CyclinD1和Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過對HERC4在宮頸癌細(xì)胞中生物功能的研究，為HERC4參與宮頸癌發(fā)生的分子機制的研究以及宮頸癌靶向治療的研究提供了新的思路。通過進(jìn)一步大量收集臨床資料齊全的樣本，分析HERC4作為宮頸癌分子診斷標(biāo)志物以及治療靶標(biāo)的可能，結(jié)合快速發(fā)展的RNAi技術(shù)治療腫瘤，將為宮頸癌的基因治療開辟更廣闊的前景。

作者：危敏1，張艷玲2，陳嵐3，蔡翠霞1，王涵多3 單位：1.深圳市南山區(qū)婦幼保健院，2.廣州軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基因工程研究所