槲皮素對宮頸癌細胞增殖的影響范文

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【摘要】目的：探討槲皮素對于人宮頸癌細胞SiHa的作用及機制。方法：用不同濃度的槲皮素（0、20、40和80μmol/L）處理SiHa細胞不同時間后（24h，48h和72h），通過噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力的變化；通過流式細胞儀檢測槲皮素對細胞周期的影響；通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白質印跡法（Westernblotting）檢測槲皮素對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達的影響。結果：MTT法檢測結果顯示，槲皮素處理SiHa細胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L組的細胞活力低于對照組（P＜0.05）；槲皮素處理SiHa細胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L組的細胞活力低于對照組（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L組，隨著培養時間延長，細胞活力較24h時降低（P＜0.05）。流式細胞儀檢測結果顯示，SiHa細胞經過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期的細胞百分比明顯高于對照組。RT-PCR和Westernblotting結果顯示，槲皮素可以下調SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達。結論：槲皮素通過下調SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達，可以抑制SiHa細胞的活力和增殖。

【關鍵詞】槲皮素；宮頸腫瘤；細胞周期蛋白D1；細胞增殖

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，宮頸癌的發病率僅次于乳腺癌，高居女性惡性腫瘤的第2位，而世界每年宮頸癌的新發病例為50多萬人，因罹患宮頸癌而死亡的病人有20多萬，是一種嚴重危害女性健康的惡性疾病[1]。槲皮素（quercetin，Que）廣泛分布于植物的果實、葉子以及花中，是一種天然的多羥基黃酮類化合物，具有很高的藥用價值，研究表明槲皮素具有多種藥理活性，包括抗炎癥、抗氧化、抗病毒、調節血脂、降血壓及保護心肌缺血再灌注等作用。目前研究表明，槲皮素不僅可以抑制多種腫瘤細胞的增殖，還可以降低腫瘤細胞遷移和侵襲的能力，在多種惡性腫瘤具有抗腫瘤的生物學作用[2]。但是，槲皮素對人宮頸癌SiHa細胞增殖的影響目前還不清楚。因此，本研究通過使用槲皮素處理人宮頸癌SiHa細胞，研究槲皮素對人宮頸癌SiHa細胞的影響，并初步探討槲皮素在SiHa細胞中的作用機制，從而為槲皮素的臨床應用提供相關的實驗基礎。

1材料與方法

1.1材料

人宮頸癌SiHa細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。槲皮素購于美國Sigma公司，DMEM培養基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司，細胞周期蛋白D1鼠單克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體均購于美國SantaCruz公司，二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司，噻唑藍（MTT）試劑購于美國Sigma公司，RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司，一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、瓊脂糖購于美國TaKaRa公司，其余為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1細胞培養

人宮頸癌SiHa細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于含5%CO2的37℃孵箱中進行常規培養，每3～4d用胰酶消化，傳代1次。

1.2.2槲皮素的配置與實驗分組

將槲皮素溶解于DMSO中配置成儲存母液，于-20℃冰箱保存。在進行實驗時，用DMEM培養基分別進行稀釋，DMSO的最終濃度＜0.1%。對數生長期的人宮頸癌SiHa細胞分為對照組（DMEM培養基+DMSO，槲皮素濃度為0μmol/L）和實驗組（槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L）。

1.2.3MTT法檢測細胞活力

將處于對數生長期的人宮頸癌SiHa細胞通過胰酶消化后，制成單細胞懸液，以3×104的細胞濃度接種于96孔細胞培養板中，每孔加入200μL的DMEM培養基。次日，待細胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養基進行培養（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），分別培養24、48、72h后，吸棄各孔內的培養基，分別加入100μL的MTT（5g/L），37℃孵育4h后吸棄各孔中的上清液，分別加入150μLDMSO，于搖床震蕩10min后，用酶標儀測定490nm波長處每孔的光密度值（OD），每組均設置3個復孔。細胞活力的計算公式：細胞活力（%）＝（槲皮素組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期

將處于對數生長期的人宮頸癌SiHa細胞通過胰酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，次日待細胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續培養48h后，通過胰酶常規消化并收集各組細胞，1000r/min離心5min后，吸棄上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞2次后，加入預冷的70%的乙醇，于4℃冰箱固定細胞12h，之后1000r/min離心5min，PBS洗滌細胞2次，用含0.01%核糖核酸酶（RNase）的碘化丙啶（PI）染液處理細胞后，避光染色30min后，使用流式細胞儀進行檢測，通過CellQuest軟件分析結果，每組均設置3個復孔。

1.2.5RT-PCR將處于對數生長期的人宮頸癌

SiHa細胞通過胰酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，次日待細胞貼壁后，更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續培養48h后收集各組細胞，按照RNA提取試劑盒提取總RNA，以CyclinD1引物進行RT-PCR檢測，上游5′-GAACACCAGCTCCTGTGCT－GCG-3′；下游5′-TGTCCACGTCCCGCACGTT-3′；擴增產物大小為880bp。

1.2.6蛋白質印跡法（Westernblotting）

將處于對數生長期的人宮頸癌SiHa細胞通過胰酶消化后，接種于6孔細胞培養板中，次日待細胞貼壁后,更換為含有不同濃度槲皮素的DMEM培養基（槲皮素濃度分別為0、20、40和80μmol/L），繼續培養48h后收集各組細胞，分別加入細胞裂解液收集細胞蛋白，并測定各組細胞的蛋白濃度。將蛋白樣本與蛋白質分子質量標準分別上樣于加樣孔，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白。電泳結束后，進行轉膜，轉膜結束后，將膜移至含5%的脫脂奶粉的Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）中室溫封閉1h，用TBST洗膜10min×4次。加入一抗，4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜10min×4次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，TBST洗膜10min×4次，然后用化學發光檢測液進行發光反應，于暗室中曝光。

1.3統計學方法

采用SPSS12.0軟件進行統計學分析。定量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用析因設計的方差分析和單因素方差分析，2組樣本間的均數比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1槲皮素對人宮頸癌細胞SiHa的細胞活力影響

MTT法檢測結果顯示，槲皮素處理SiHa細胞24h和48h后，40μmol/L和80μmol/L組的細胞活力低于對照組，槲皮素處理SiHa細胞72h后，20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L組的細胞活力低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；在40μmol/L和80μmol/L組，隨著培養時間延長，細胞活力較24h時降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2槲皮素對SiHa細胞細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，SiHa細胞經過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期細胞的百分比分別為（58.46±1.58）%、（64.92±1.15）%和（71.50±1.18）%，與對照組（52.24±1.46）%相比均升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。此外，SiHa細胞經過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于S期細胞的百分比分別為（35.48±0.91）%、（26.53±1.93）%和（21.96±0.33）%，與對照組（41.63±2.11）%相比均減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3槲皮素對SiHa細胞中CyclinD1蛋白表達的影響

RT-PCR和Westernblotting結果顯示，在使用不同濃度的槲皮素處理SiHa細胞48h后（槲皮素濃度分別為20、40和80μmol/L），SiHa細胞中CyclinD1在轉錄水平以及蛋白水平的表達均出現了不同程度的下調，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3討論

槲皮素是一種廣泛分布于植物的果實、葉子以及花中的多羥基黃酮類化合物，目前在100多種中草藥中均可以檢測到槲皮素的存在，其主要的生物學功能包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎癥以及保護心血管等。研究表明，槲皮素對于多種惡性腫瘤細胞具有抑制作用[3]。在乳腺癌中，槲皮素發揮雌激素樣的作用，可以抑制乳腺癌細胞的增殖[4-5]。在肝癌細胞中，槲皮素可以通過誘導細胞凋亡而抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖[6-8]。而在結腸癌中，槲皮素可以通過上調p21和p27蛋白的表達，使人結腸腺癌細胞RKO的細胞周期阻滯于G0/G1期，從而抑制人結腸腺癌細胞RKO的增殖[9]。同樣的，在卵巢癌細胞中，槲皮素也可以阻止細胞周期從G0/G1期向S期的轉換，從而抑制卵巢癌細胞的增殖[10]。本研究MTT的結果顯示，在槲皮素處理時間相同的條件下，隨著槲皮素濃度的增加，槲皮素對于SiHa細胞活力的抑制作用逐漸增強。

同樣的，在槲皮素濃度相同的條件下，隨著作用時間的增加，槲皮素對于SiHa細胞活力的抑制作用也逐漸增強。因此，槲皮素可以抑制SiHa細胞的細胞活力和細胞增殖。此外，通過流式細胞儀分析槲皮素處理后SiHa細胞中細胞周期的變化，發現SiHa細胞經過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于G0/G1期的細胞百分比與對照組相比均出現了增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；而SiHa細胞經過20、40和80μmol/L濃度的槲皮素分別處理48h后，處于S期的細胞百分比與對照組相比均出現了減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。可見，槲皮素可以阻滯細胞周期從G0/G1向S期的轉換，增加G0/G1期的細胞數量，同時減少S期的細胞數量，這些結果與槲皮素在結腸癌[10]以及卵巢癌[11]中所觀察到的可以阻滯腫瘤細胞從G0/G1期向S期轉換的結果是一致的。

此外，通過檢測周期相關蛋白CyclinD1的表達發現，槲皮素可以下調SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達，隨著濃度的增加，槲皮素對CyclinD1表達抑制的作用出現了進一步的加強。因此，結合MTT以及細胞周期的結果，推測槲皮素可以通過下調SiHa細胞中CyclinD1蛋白的表達，從而阻滯腫瘤細胞從G0/G1期向S期的轉換，抑制SiHa細胞的增殖和活力。綜上所述，槲皮素可以抑制SiHa細胞的增殖和活力，而這種抑制作用可能是通過調節周期相關蛋白CyclinD1的表達來實現的，但是槲皮素具體通過何種途徑實現其對CyclinD1表達的調控還有待進一步的研究。

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[10]鄧曉慧，宋海巖，孫春莉.槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響[J].中國病理生理雜志，2013，29（1）：99-102.

作者：張欣；董春力；付麗麗；杜鵑；李少聞