白血病的DKK1基因研究范文

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白血病是一種造血干細胞惡性克隆性疾病，與表觀遺傳學的改變密切相關，其中關于DNA甲基化為當今研究熱點之一。由于大量研究表明白血病的發(fā)生與dkk1基因甲基化狀態(tài)有密切關系，因此我們就DKK1甲基化與白血病的研究進行了綜述。DKK1基因與Wnt/β-catenin信號通路Dickkopf-1(DKK1)是Glinka等首次在兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細胞中發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，屬于DKKs家族成員。人類的DKK1基因位于10q11，含有2個富含半胱氨酸的保守區(qū)域Cys1和Cys2，由266個氨基酸組成，其相對分子質量在29kDa左右，N端經糖基化修飾后其相對分子質量在35kDa左右，目前確認的結合受體有低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP-5與LRP-6)和跨膜蛋白(Kremen)受體兩類。研究揭示DKK1基因啟動子區(qū)域甲基化改變與多種疾病的發(fā)生發(fā)展及預后有關，如乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、腎細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、白血病等。所謂基因甲基化是指DNA復制后，在DNA甲基化轉移酶(DNMT)的介導下，催化腺苷甲硫氨酸的甲基轉移到DNA分子中形成5-甲基胞嘧啶，從而生成甲基化的DNA。DKK1基因正常情況下其啟動子區(qū)域CpG島是處于非甲基化狀態(tài)的，一旦該區(qū)域出現(xiàn)了高甲基化，就會導致DKK1基因轉錄沉默。

大量研究表明，通過與Wnt信號通路上相應的受體結合，DKK1對細胞的分化、增殖、遷移或癌變等特性進行調控，在腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路參與胚胎發(fā)育及腫瘤形成，同時與造血系統(tǒng)發(fā)育、造血干細胞自我更新及某些惡性血液病密切相關。當細胞分泌的Wnt蛋白與細胞跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)結合后，在輔助受體LRP-5/LRP-6的協(xié)同作用下，激活細胞內的信號轉導，使胞質內散亂蛋白(dishevelled)發(fā)生磷酸化而活化。磷酸化的散亂蛋白抑制了GSK-3β的活性，使β-catenin不能與Axin-APC-GSK-3β等形成降解復合物，從而使胞漿內游離的β-catenin蛋白積聚，進入細胞核，與淋巴增強因子(lymphoid-en-hancingfactor，LEF)/T細胞因子(T-cellfactor，TCF)結合，形成β-catenin/TCF/LEF轉錄復合體，使下游靶基因如C-MYC、cyclinD1等轉錄和表達增高(附圖)，最終促進腫瘤的發(fā)生。Mao等發(fā)現(xiàn)，DKK1作用通路是通過競爭Wnt蛋白結合LRP5/6受體而直接抑制Wnt蛋白活性，或通過含kringle結構域的Kremen受體間接與LRP5/6受體結合，從而形成三聚體復合物，降低Wnt蛋白向細胞內傳導信號，阻斷經典Wnt/β-catenin/TCF傳導通路，抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，誘導其凋亡。

一、DKK1甲基化與急性白血病

急性白血病(acuteleukemia，AL)是一種與表觀遺傳學相關的疾病，具有多基因、遺傳學表型異質性特點。大量研究表明，AL的發(fā)生與DKK1基因表達異常有密切關系。DKK1基因甲基化，引起基因表達下調或沉默，其抑制Wnt信號通路作用失活，導致Wnt信號通路激活，進而引起腫瘤的發(fā)生。Griffiths等［9］研究表明，在169名原發(fā)性AML患者中，89%的患者骨髓冰凍樣本或外周血組織樣本有1個以上的抑制基因發(fā)生甲基化，其中DKK1甲基化率為16%，且其甲基化與AML患者的不良預后存在相關性;在檢測的白血病細胞系(HL-60，K562，KG1，HNT34，KG1a，U937和HCT116)中至少50%的細胞都會發(fā)生DKK1甲基化。Valencia等［10］研究表明，在AML細胞系(kasumi-1，KGla，HL-60，THP-1)中DKK1基因都發(fā)生高甲基化，184例AML患者DKK1基因啟動子區(qū)域高甲基化狀態(tài)，甲基化發(fā)生率為32%。Suzuki等［11］研究發(fā)現(xiàn)，5例正常骨髓單核細胞樣本DKK1不發(fā)生甲基化，而47例AML患者骨髓樣本中DKK1甲基化率為29．8%，其中M2型病人更容易檢測到DKK1的甲基化，甲基化發(fā)生率為42．3%，10個伴t(8;21)染色體易位的AML患者中有5人發(fā)生DKK1甲基化。Raji、Molt-3和SK-NO-1細胞系均可觀察到DKK1甲基化，且多變量分析顯示DKK1甲基化是不良預后的一個危險因素，與白血病的疾病進展有關，但病人的5年總生存率與是否發(fā)生DKK1甲基化沒有明顯的相關性;研究還發(fā)現(xiàn)，RUNX1/RUNX1T1，CBFB-MYH11或者PML-RARA融合基因常與DKK1甲基化伴隨發(fā)生，均促進白血病形成，而存在FLT3/ITD突變的11個AML患者沒有發(fā)現(xiàn)DKK1基因甲基化。這些結果顯示，F(xiàn)LT3/ITD突變可能不與DKK1甲基化同時發(fā)生。Hou等［12］發(fā)現(xiàn)，在269例AML患者中，166人有1個以上的Wnt抑制基因發(fā)生甲基化，其中DKK1甲基化率為30．1%。這些研究表明所有的Wnt抑制基因的異常甲基化導致的甲基化上調可能是Wnt抑制基因失活的主要機制。國內朱珣珣等［13］研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，AL患者DKK1基因mRNA表達顯著降低，正常對照組單個核細胞標本不存在DKK1的甲基化，但AL患者中DKK1甲基化率為37．7%，其中急性淋巴細胞白血病(ALL)患者甲基化率為41．2%，AML患者中甲基化率為28．6%。一系列的研究發(fā)現(xiàn)，當DKK1基因啟動子區(qū)域高甲基化，mRNA轉錄水平降低，DKK1蛋白表達降低，導致Wnt通路激活，從而引起AL的發(fā)生，且DKK1甲基化程度與病情的嚴重程度及預后有關。

二、DKK1甲基化與慢性白血病

慢性粒細胞白血病(CML)是具有Ph染色體和/或BCR-ABL融合基因陽性的造血干細胞惡性增殖性疾病。朱雅姝等［14］研究表明，脂肪間充質干細胞分泌的DKK1可以抑制慢性髓細胞白血病細胞K562的增殖。將DKK1基因用RNA干擾后與K562細胞共培養(yǎng)，可重新增加K562細胞Wnt信號通路中β-catenin表達，減弱對K562增殖的抑制作用。Zhu等［15］人研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞分泌的DKK1蛋白是Wnt信號通路強有力的抑制劑，可以抑制K562細胞增殖;當DKK1基因被敲除或者使用抗體中和DKK1蛋白，DKK1對共培養(yǎng)的K562細胞的抑制作用則降低。Han等［16］研究表明，DKK1蛋白可以通過抑制Wnt信號通路，降低β-catenin含量，導致K562細胞凋亡增加，逆轉最終急變期CML的骨髓間充質干細胞對K562細胞的保護作用，使β-cate-nin水平降低。Filipovich等［17］研究發(fā)現(xiàn)，盡管Wnt信號通路在CLL中激活，而健康的B淋巴細胞和CLL細胞表達的DKK1基因mRNA及LRP6水平是等量的，在CLL中DKK1可能不發(fā)揮作用。然而Moskalev等［18］人研究表明，在CLL中DKK1甲基化水平明顯高于對照組，在EHEB和MEC-1細胞系中，DKK1甲基化發(fā)生率分別為68%和75%，12個CLL病人樣本中DKK1甲基化發(fā)生率為34%。研究結果的差異可能由于選擇的樣本影響或者樣本數(shù)量有限或者別的實驗因素的影響，這需要進一步研究證明。這些研究表明，不同類型的慢性白血病中DKK1所起的作用可能不同，這為以后更深入的研究DKK1基因在慢性白血病中的功能提供參考。

三、白血病去甲基化治療的新進展

去甲基化藥物主要是指DNMT抑制劑。此類藥物在小細胞肺癌、乳腺癌、白血病及骨髓增生異常綜合征等疾病中的應用，獲得了顯著的療效。去甲基化藥物地西他濱(5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶，DAC)是一種天然的脫氧胞苷酸的腺苷類似物，特異性的DNA甲基化轉移酶抑制劑，可逆轉DNA的甲基化過程，激活沉默失活的抑癌基因，從而誘導腫瘤細胞向正常細胞分化或誘導腫瘤細胞凋亡。Moskalev等［18］研究表明，5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶在CLL細胞系中可以降低DKK1基因甲基化水平，然而并沒有導致明顯的DKK1基因的mRNA水平表達增加。Suzuki等［11］研究發(fā)現(xiàn)，當AML細胞株(SKNO-1)使用5-氮雜-胞嘧啶治療4d后，觀察到DKK1基因表達恢復，這提示DKK1甲基化抑制了DKK1基因表達。Va-lencia等［10］研究表明，地西他濱治療AML后，DKK1基因的表達水平呈劑量依賴性增加。孟真等［19］研究發(fā)現(xiàn)，使用去甲基化藥物三氧化二砷后在原本不表達抑癌基因SHP-1mRNA的HL-60細胞中，SHP-1得到表達，而高表達的原癌基因C-kit表達水平下降。當使用不同濃度的三氧化二砷作用后，SHP-1mRNA的表達水平呈劑量依賴性地上升，而C-kitmRNA的表達水平隨劑量增加而下降。雖然地西他濱在白血病的治療中取得了明顯療效，但由于使所有基因去甲基化，因此也有可能誘導腫瘤的發(fā)生。目前的研究主要是靶向誘導DKK1去甲基化，這在白血病中還沒有新進展，但在多發(fā)性骨髓瘤已取得一定的成果。如針對DKK1蛋白抑制成骨細胞激活破骨細胞而導致的溶骨性病變，可使用DKK1的中和抗體、蛋白酶體抑制劑、多肽疫苗免疫治療及調節(jié)因子等，這些方法均顯示出較好的療效［20］。另有研究表明，在結腸直腸癌中使用生物活性物質維生素D3可以通過增加DKK1基因表達來調控Wnt/β-catenin信號通路［21］。使用維生素D3(100nmol/L)治療結腸直腸癌細胞株SW480-ADH，2d后腫瘤抑制基因DKK1表達增加，而致癌基因DKK4表達降低，其具體的機制還有待進一步研究證實，但這也為我們治療提供了一個方向，或許在白血病治療中也有一定的參考意義。

四、問題與展望

白血病作為一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤一直威脅到人類的健康，應用去甲基化藥物治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤已經成為目前的研究熱點。由于基因甲基化的異常改變通常先于腫瘤的發(fā)生，而腫瘤細胞壞死和凋亡產生的DNA又會游離到血漿、血清、痰、尿液等體液中，因此可以檢測這些體液中DKK1基因的甲基化情況，為腫瘤的早期診斷提供依據(jù)［22］。DKK1甲基化具有可逆性，因此去甲基化治療可以使其恢復表達，起到抗腫瘤作用。但目前去甲基化藥物治療存在一定的問題，首先是其缺乏特異的靶向性。因此，在恢復抑癌基因表達的同時可能引起原癌基因以及全基因組的低甲基化從而誘發(fā)腫瘤。其次，這類藥物具有可逆性，使用藥物可以暫時使DKK1基因去甲基化，但仍有可能恢復到高甲基化狀態(tài)，故需要長期持續(xù)應用才可以達到一定的效果，而大劑量應用去甲基化藥物會對正常細胞產生細胞毒副作用。因此，尋找針對不同的抑癌基因的靶向的甲基化藥物成為研究的重點以及難點。

作者：柳鳳芝 王季石 朱紅倩 單位：貴州省人民醫(yī)院血液科 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液科