急性白血病細胞增殖的影響范文

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p90核糖體S6激酶（p90ribosomalS6kinase，RSK）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular-signalregulatedkinase，ERK）信號通路下游重要的調控因子。在哺乳動物中，RSK家族有RSK1、RSK2、RSK3和RSK4這4個亞型，約73%～80%的氨基酸序列相同。RSK蛋白結構最顯著的特性是具有2個功能區域，即C末端激酶活性區（C-terminalkinasedomain，CTKD）及N末端激酶活性區（N-terminalkinasedomain，NTKD）。RSK1～3亞型的CTKD主要是接受上游的ERK信號，通過一系列絲氨酸部位的磷酸化及自身磷酸化而快速有效地激活NTKD，從而對RSK底物進行磷酸化，在調節細胞核信號、細胞周期、細胞增殖和蛋白合成等方面發揮重要作用。盡管在人類腫瘤中未發現RSK基因突變，但目前認為RSK1和RSK2為致癌基因，在惡性腫瘤的發生和發展中起促進作用[2-5]。RSK特異性抑制劑BI-D1870可通過和ATP競爭性結合NTKD區域，特異性抑制RSK活性而不影響其他天冬氨酸谷氨酸轉運蛋白激酶[如：AMP活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）、MAPK及死亡相關蛋白激酶（death-associatedproteinkinase，DAPK）等]的活性[6]。BI-D1870可抑制多種類型實體腫瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡[6-8]。關于BI-D1870對急性白血病（acuteleukemia，AL）細胞的作用及其機制尚未明確，本研究主要探討BI-D1870聯合依托泊苷對人類AL細胞的細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期分布的影響。

1材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640培養液和胎牛血清購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液購自美國Mediatech公司，DMSO購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，實時熒光定量PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RSK抑制劑BI-D1870購自美國Selleck公司，化療藥物依托泊苷注射液購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，CCK-8購自日本Dojindo公司，AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、熒光染料碘化丙啶（propidiumiodide，PI）和細胞周期檢測試劑盒均購自美國BD公司。

1.2細胞及細胞培養急性T淋巴細胞白血病細胞Molt-4和Jurkat、急性B淋巴細胞白血病（acuteB-lymphoblasticleukemia，B-ALL）細胞Nalm-6、急性單核細胞白血病（acutemonocyticleukemia，AML）細胞THP1和U937以及急性早幼粒白血病細胞NB-4這6種人類AL細胞均由同濟大學附屬同濟醫院藥物臨床試驗研究機構所屬實驗室傳代培養。這6種細胞均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，置于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3實時熒光定量PCR法檢測AL細胞中RSK1和RSK2mRNA的表達水平收集上述6種AL細胞及用淋巴細胞分離液分離的健康志愿者外周血單核細胞，按照總RNA提取試劑盒操作說明書提供的方法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定D260nm/D280nm的值，鑒定RNA的純度和濃量。應用反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒將1μg總RNA反轉錄合成cDNA，以此cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，檢測細胞中RSK1和RSK2mRNA的表達水平。RSK1上游引物序列為5’-ATT-GGTGTGGGCTCCTACTC-3’，下游引物序列為5’-CATACAGGATGTTGCTGGGC-3’；RSK2上游引物序列為5’-ATCAAGCCACCGT-TCAAACC-3’，下游引物序列為5’-ACTCGGT-GTCTGTGGCTTTA-3’；內參照β-actin上游引物序列為5’-CTGGATTCTGGCGATGGT-GTA-3’，下游引物序列為5’-CGGACAATT-TCACGTTCAGCA-3’。PCR反應條件：95℃預變性30s；95℃5s、60℃34s、72℃延伸40s，共40個循環。以2－ΔCt法計算RSK1和RSK2mRNA的表達水平，ΔCt＝目的基因Ct值－內參照基因Ct值。

1.4CCK-8法檢測BI-D1870和依托泊苷對AL細胞增殖的影響

1.4.1BI-D1870對Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4細胞增殖的影響取對數生長期的Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4細胞接種于96孔板中（1×105個/mL，100μL/孔），并給予10.0μmol/L[6]BI-D1870處理（BI-D1870用DMSO配制，作為實驗組），同時設置對照組（細胞用含與BI-D1870處理組相同濃度的DMSO進行處理）和空白組（不含細胞的培養液），每組設3個復孔。當BI-D1870處理細胞0、6、12、24和48h時，加入CCK-810μL/孔，37℃反應2h，上酶聯免疫檢測儀測定波長為450nm處各孔的吸光度（D）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）＝1－（實驗組D值－空白組D值）/（對照組D值－空白組D值）×100%。

1.4.2不同濃度BI-D1870及依托泊苷單藥對Molt-4細胞增殖的影響按1.4.1節的方法接種Molt-4細胞，分別給予0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μmol/L的BI-D1870及0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL的依托泊苷單藥處理，對照組和空白組的設置與1.4.1節的方法相同，每組設3個復孔。BI-D1870和依托泊苷單藥處理細胞24h后，加入CCK-810μL/孔，37℃反應2h，上酶聯免疫檢測儀測定波長為450nm處各孔的吸光度（D）值。按1.4.1節的方法計算細胞增殖抑制率，應用Excel軟件計算BI-D1870和依托泊苷作用Molt-4細胞24h的半數抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）值。

1.4.3BI-D1870聯合依托泊苷對Molt-4細胞增殖的影響按1.4.1節的方法接種Molt-4細胞，分別給予40%和60%IC50值的BI-D1870（即3.0μmol/L和4.0μmol/L）和依托泊苷（即0.2μg/mL和0.3μg/mL）單藥及BI-D1870聯合依托泊苷處理Molt-4細胞，對照組的設置與1.4.1節的方法相同，每組設3個復孔。BI-D1870和依托泊苷單藥及BI-D1870聯合依托泊苷處理細胞24h后，加入CCK-810μL/孔，37℃反應2h，上酶聯免疫檢測儀測定450nm波長處各孔的吸光度（D）值。按1.4.1節的方法計算細胞增殖抑制率，并應用金（正均）氏公式[Q＝E（a＋b）/（Ea＋Eb－Ea×Eb），Ea為BI-D1870單藥干預后的細胞增殖抑制率，Eb為依托泊苷單藥干預后的細胞增殖抑制率，E（a＋b）為聯合用藥干預后的細胞增殖抑制率]判定2種藥物間的相互作用。當Q＜0.85時，2藥聯合具有拮抗作用；當0.85≤Q＜1.15時，2藥聯合為單純相加作用；當Q≥1.15時，2藥聯合具有協同作用。

1.5FCM法檢測BI-D1870和依托泊苷對Molt-4細胞凋亡及細胞周期分布的影響

1.5.1BI-D1870對Molt-4細胞凋亡的影響取對數生長期的Molt-4細胞接種于6孔板中（1.5×106個/孔），給予7.0μmol/L的BI-D1870（BI-D1870的IC50值為7.0μmol/L）處理，對照組的設置與1.4.1節的方法相同。BI-D1870處理Molt-4細胞24h后，應用AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。收集待檢測的各組細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，PBS洗滌后，加入100μL1×BindingBuffer、5μLAnnexinⅤ-FITC和5μLPI，室溫避光反應15min；加入400μL1×BindingBuffer，4℃避光反應15min，于1h內上流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.5.2BI-D1870對Molt-4細胞周期分布的影響取對數生長期的Molt-4細胞接種于直徑為10cm的培養皿中（密度為5×106個/皿），給予7.0μmol/L的BI-D1870處理，對照組的設置與1.4.1節的方法相同。收集BI-D1870作用24h后的Molt-4細胞，應用細胞周期檢測試劑盒檢測Molt-4細胞的細胞周期分布情況。在收集的細胞中加入6mL75%的乙醇溶液，4℃固定過夜；PBS洗滌細胞，將細胞重懸于0.5mLPI染色液中，室溫避光反應15min，于1h內上流式細胞儀（上流式細胞儀分析前，樣品置于4℃避光保存）分析細胞周期的分布情況。

1.5.3BI-D1870聯合依托泊苷對Molt-4細胞凋亡的影響取對數生長期的Molt-4細胞接種于6孔板中（1.5×106個/孔），分別給予4.0μmol/L的BI-D1870和0.3μg/mL的依托泊苷單藥及4.0μmol/L的BI-D1870聯合0.3μg/mL的依托泊苷處理，對照組的設置與1.4.1節的方法相同。收集藥物處理24h后的各組細胞，按1.5.1節的方法檢測各組細胞的細胞凋亡情況。

1.6統計學方法本研究中的各項實驗均重復3次。應用SPSS13.0軟件對實驗的結果數據進行統計分析。計量資料以±s表示，兩獨立樣本間的比較采用t檢驗；多組間均數的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1多種AL細胞中RSK1和RSK2mRNA的表達水平上調應用實時熒光定量PCR法檢測了6種AL細胞及健康志愿者外周血單核細胞中RSK1和RSK2mRNA的表達水平。結果（圖1）顯示，除Nalm-6細胞以外，Molt-4和THP1細胞中RSK1mRNA的表達水平以及Molt-4、Jurkat、THP1、U937和NB-4細胞中RSK2mRNA的表達水平均高于健康志愿者外周血單核細胞（P值均＜0.05）。

2.2RSK抑制劑BI-D1870和依托泊苷抑制AL細胞的增殖

2.2.1BI-D1870可顯著抑制AL細胞的增殖應用CCK-8法檢測10.0μmol/L的BI-D1870處理Molt-4、Jurkat、Nalm-6、THP1、U937和NB-4細胞0、6、12、24和48h后細胞的增殖情況。結果（圖2A）顯示，隨著BI-D1870作用時間的延長，6種細胞的增殖抑制率逐漸遞增（P＜0.05），以Nalm-6和Molt-4細胞較為顯著。

2.2.2BI-D1870與依托泊苷可協同抑制Molt-4細胞的增殖分別給予Molt-4細胞0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μmol/L的BI-D1870及0.125、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL的依托泊苷單藥處理24h后，應用CCK-8法檢測細胞的增殖情況并計算BI-D1870和依托泊苷作用Molt-4細胞24h的IC50值。結果（圖2B和2C）顯示，BI-D1870和依托泊苷作用于Molt-4細胞24h的IC50值分別為7μmol/L和0.5μg/mL。分別給予40%和60%IC50值的BI-D1870（即3.0μmol/L和4.0μmol/L）和依托泊苷（即0.2μg/mL和0.3μg/mL）單藥及BI-D1870聯合依托泊苷處理Molt-4細胞24h后，應用CCK-8法檢測細胞的增殖情況，并計算2藥聯合的Q值。結果（圖2D和2E）顯示，2藥聯合組細胞的增殖抑制率高于各單藥組（P值均＜0.01）。3.0μmol/L的BI-D1870聯合0.2μg/mL的依托泊苷作用時，Q＝1.19；4.0μmol/L的BI-D1870聯合0.3μg/mL的依托泊苷作用時，Q＝1.20。因此，BI-D1870聯合依托泊苷可協同抑制Molt-4細胞的增殖。

2.3BI-D1870和依托泊苷促進AL細胞的凋亡并阻滯細胞周期進程

2.3.1BI-D1870可誘導Molt-4細胞凋亡并阻滯細胞周期于G2/M期FCM法檢測7.0μmol/L的BI-D1870處理Molt-4細胞24h后細胞的凋亡和周期分布情況。結果（圖3A和3B）顯示，BI-D1870處理組Molt-4細胞的凋亡率明顯高于對照組（P＜0.01）；BI-D1870處理組G2/M期細胞所占百分比明顯高于對照組（P＜0.05）。

2.3.2BI-D1870可增強依托泊苷誘導的Molt-4細胞凋亡FCM法檢測4.0μmol/L的BI-D1870和0.3μg/mL的依托泊苷單藥及4.0μmol/L的BI-D1870聯合0.3μg/mL的依托泊苷處理24h后Molt-4細胞的凋亡情況。結果（圖3C）顯示，BI-D1870和依托泊苷單藥處理組Molt-4細胞的凋亡率均明顯高于對照組（P值均＜0.05），并且BI-D1870聯合依托泊苷處理組Molt-4細胞的凋亡率明顯高于各單藥組（P值均＜0.01）。這一結果說明，BI-D1870可促進依托泊苷誘導的細胞凋亡。

3討論

AL是造血干細胞的惡性克隆性疾病，其克隆的白血病細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，細胞發育停滯于較早階段[9]。化療仍是目前治療AL的主要方法，雖然大部分AL患者化療后能夠獲得較高的緩解率，但化療藥物的不良反應較大，有時甚至危及生命，而且部分患者在獲得完全緩解后會出現疾病復發或對目前傳統的化療藥物有原發性耐藥，預后極差。因此，探索新的靶向藥物已成為當今AL亟待解決的問題。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是細胞重要的MAPK通路之一，常常在生長因子、細胞因子及分裂素等刺激后被激活，介導細胞的分化、增殖、存活及原癌基因的轉化。MAPK/ERK信號通路在人類惡性腫瘤中常被異常激活，在惡性腫瘤的發生和發展中起著重要的作用。而且，30%以上惡性腫瘤患者存在MAPK/ERK信號通路的基因突變，并在AL中發生更為頻繁。Ras、Kit和Fms樣酪氨酸激酶（3Fms-liketyrosinekinase3，Flt3）以及血小板衍生生長因子受體（platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR）等基因突變可導致MAPK/ERK信號通路的異常激活。MAPK/ERK通路的基因突變是不良預后的相關因子，與白血病化療藥物的耐藥密切相關[10]。染色體易位產生的融合基因Bcr/Abl、融合基因TEL（translocationerythroblasttransformation-specificleukemia）/PDGFR等也可激活該通路。

另外，某些化療藥物會誘發MAPK/ERK的級聯反應，促進耐藥的發生。因此，阻斷MAPK/ERK通路有望增強傳統化療藥物的療效，克服耐藥性，改善AL患者的預后。目前已經開發了針對Ras、Raf、MEK及ERK的抑制劑，并開始用于臨床試驗。雖然這些抑制劑表現出了相應的療效，但仍會發生復雜的并發癥。RSK是位于MAPK/ERK信號通路下游的重要調控因子，通過對底物進行磷酸化而調節細胞核信號、細胞周期、細胞增殖、蛋白合成和細胞移行等[1]。研究發現，RSK1和RSK2在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤及骨肉瘤等多種實體腫瘤細胞中高表達，且伴有蛋白活性的增高；抑制RSK活性或敲除RSK1和RSK2的表達可抑制實體腫瘤細胞的增殖。本研究發現，RSK1和RSK2mRNA在多種AL細胞中高表達；RSK抑制劑BI-D1870可抑制多種AL細胞的增殖，誘導Molt-4細胞凋亡并將其阻滯于G2/M期。雖然在Nalm-6細胞中RSK1和RSK2mRNA的表達水平較低，但BI-D1870對Nalm-6細胞的增殖抑制率最高，筆者認為這可能與該細胞中RSK蛋白活性增高或其他機制有關，具體機制有待進一步研究。

大多數化療藥物（如：依托泊苷等）主要是通過破壞白血病細胞DNA的完整性，誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤的作用[14]。然而，化療藥物造成的DNA損傷可激活細胞內DNA損傷應答信號通路，使受損的DNA得到及時修復，從而減弱化療藥物的療效或導致耐藥的發生。完整的DNA損傷應答信號通路包括DNA損傷感知復合物DNA損傷修復蛋白、毛細血管擴張性共濟失調癥突變激酶、Rad3相關激酶、DNA依賴性蛋白激酶、細胞周期檢控點激酶、效應復合物和細胞分裂周期基因。研究發現，RSK可通過直接磷酸化細胞周期檢控點激酶1的Ser280位點，改變細胞周期檢控點激酶1在細胞內的位置或細胞周期檢控點激酶1活性，促進腫瘤細胞的DNA損傷應答[15]。DNA損傷亦可激活RSK2，使其在細胞核內與毛細血管擴張性共濟失調癥突變相互作用，通過毛細血管擴張性共濟失調癥突變/p53信號通路，促進DNA損傷的修復[16]。本研究檢測了BI-D1870聯合依托泊苷對Molt-4細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期的影響，考慮到應用BI-D1870和依托泊苷≥IC50值的藥物濃度處理細胞可能無法有效觀察二者的協同效應，因此本研究選用BI-D1870和依托泊苷40%和60%IC50值的濃度處理細胞，發現BI-D1870聯合依托泊苷可協同抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡。筆者推測，通過抑制化療藥物所激活的DNA損傷應答反應可能是RSK抑制劑的作用機制之一。綜上所述，RSK1和RSK2mRNA在多種AL細胞中呈高表達；RSK抑制劑能有效抑制856曹雨娜，等.RSK抑制劑BI-D1870對急性白血病細胞增殖的影響多種AL細胞的增殖，其機制可能與RSK抑制劑誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期有關；而且，BI-D1870聯合化療藥物依托泊苷可協同抑制細胞的增殖，促進依托泊苷誘導的細胞凋亡。筆者推測，RSK抑制劑BI-D1870可能是治療AL潛在的分子靶向藥物。

作者：曹雨娜 張虹 方霞 葉世光 陸惠娜 李冰 李亞梅 梁愛斌 李萍 單位：同濟大學附屬同濟醫院藥物臨床試驗研究機構