基因座法醫學采集探究范文

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作者：姜先華賈菲趙金玲沈紅纓陳初光金萍郭飛李秋陽邵武于蛟單位：遼寧省刑事科學技術研究所基點認知技術有限公司中國醫科大學法醫學院

復合擴增體系的建立和優化

建立20個基因座的復合擴增體系，并進行調整、優化實驗:引物濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。引物退火溫度設置梯度(56、57、58、59、60、61、62℃)。緩沖液濃度設置梯度(0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35μmol/L)。

模板濃度以9947A標準品DNA(10ng/μL)為模板，設置梯度(0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5ng)。PCR循環次數在以上確定的最佳引物濃度、退火溫度、緩沖液濃度、DNA濃度條件下，設置PCR循環次數梯度(27、28、29、30、31、32)。

PCR產物的檢測

采用ABI3130XL型遺傳分析儀及GeneMapper3.2軟件對PCR產物進行檢測和分型。編制與復合擴增體系中的基因座相對應Panel和與等位基因數據項對應Bin，導入GeneMapper3.2軟件用于分析判型。

擴增體系指標驗證及法醫學應用

1擴增體系技術指標驗證

一致性368份無關個體血樣采用TECAN工作站磁珠法提取DNA，STR分型結果與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果進行一致性和成功率比較。靈敏度采用美國Promega公司的9947ADNA(10ng/μL)進行靈敏度檢測。模板定量為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng進行檢測，平行重復3次。種屬特異性設置人源性和非人源性檢材(豬、雞、魚)，測試方法的種屬特異性。

2案件檢材應用

血斑、混合斑、汗液斑、唾液斑、肋軟骨、肌肉組織和毛發樣本，經Chelex100法提取DNA，采用本文方法檢測，與SinofilerTM和PowerPlex16分型結果比對。

結果與討論

1檢測方法及遺傳學調查

本文最終選擇的五色熒光復合擴增總體系10μL，內含:模板DNA0.5ng、2.5×PCR緩沖液4μL、5×引物混合物2μL、GoldTaq1U0.2μL。PCR循環參數為:95℃5min;94℃30s、60℃1min、70℃1min，共30次循環;最后60℃延伸30min。電泳檢測:取1μLPCR產物、8.5μL去離子甲酰胺、0.5μLORANGE500分子量內標，混勻，95℃變性3min，立即冰浴;使用ABI3130XL型遺傳分析儀電泳分離，毛細管36cm，“DyeSet”選擇“E5”。采用GeneMapperIDv3.2軟件進行分析。結果表明，本方法可對所選20個基因座成功分型，且均衡性良好，峰型對稱尖銳、無雙肩峰等雜峰。

應用本文方法對368份無關個體血痕樣本進行檢測，19個STR基因座數據采用直接計數法和PowerStatsV12軟件(www．promega．com)進行遺傳學統計分析。結果表明:各基因座基因型觀察值和期望值之間無顯著差異，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。19個STR基因座的等位基因及其頻率以及相關遺傳學參數見表2、3。從表2、3可見，除D3S1358、CSF1PO、TPOX、TH014個基因座外均為高雜合度(H＞0.7)、高識別能力(DP＞0.9)和高信息量(PIC＞0.7)基因座。本方法累積個人識別能力為0.999999999999999999999，高于IdentifilerTM和PowerPlex16，累積非父排除率為0.99999999，可為法庭科學DNA分析工作提供更加準確的判斷依據，且可做到一次檢測獲得更多信息，對數據庫建設和實際案件有重要意義。

2方法指標驗證

一致性368份無關個體血樣經該方法檢測得到的分型與SinofilerTM和PowerPlex16相同基因座的分型結果完全一致，說明該檢測方法具有良好的準確性和一致性。靈敏度經對不同模板量進行檢測，最佳模板量為0.125～1.0ng，峰高均值在500～2000Rfu之間。

模板量低至0.0625ng仍可獲得完整STR分型結果，但峰值小于100Rfu，亦可出現雜合子峰高不均衡現象。模板量為2.0ng時，峰值達6000Rfu，易出現拔起峰及雜峰，影響結果判讀(圖1)種屬特異性采用本文方法檢測豬、魚、雞的DNA樣品，結果與IdentifilerTM所報道的種屬特異性檢測結果一致。魚和雞樣品結果為陰性，豬樣品圖譜分型區內均無擴增產物，僅在性別位點前出現103bp非特異性擴增峰，但不影響人源DNA判型(圖2)。結果表明本文方法具有良好的種屬特異性。

3實際案例檢材應用

55份案例檢材經Chelex100法提取DNA，采用本文方法進行分型檢測，與SinofilerTM和PowerPlex16結果進行比對，各基因座均獲得一致的分型結果。當檢材為低拷貝模板時，可獲得的基因座數量更多。例如某案例的甲醛固定石蠟包埋樣本，采用本文方法和SinofilerTM使用相同模板量及電泳參數進行檢測，本文方法得到10個基因座的分型，而SinofilerTM僅得到7個基因座的分型，且前者平均峰高高于后者(圖3)。

綜上，本文建立的五色熒光標記復合擴增體系，可對生物檢材20個基因座進行檢測，其個體識別能力、非父排除能力、檢測靈敏度和檢材適用性等均可達到當前商品化試劑盒的檢測水平，為法醫DNA分析檢測提供了新方法，并因其可檢測到更多基因座，故在提高數據庫比對中具有巨大應用潛力。