法醫(yī)學(xué)溺死診斷中硅藻檢驗方法的應(yīng)用范文

本站小編為你精心準備了法醫(yī)學(xué)溺死診斷中硅藻檢驗方法的應(yīng)用參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

摘要：水中尸體的死因判斷一直是法醫(yī)學(xué)實踐中的熱點問題，而硅藻檢驗被認為是一種相對可靠的診斷溺死的方法。本文通過對國內(nèi)外法醫(yī)硅藻研究進展相關(guān)文獻報道進行總結(jié)，綜述了硅藻檢驗在法醫(yī)溺死診斷中的應(yīng)用，包括法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗的發(fā)展歷史、意義及常用檢驗方法，即消化法、化學(xué)元素法、DNA分子生物學(xué)檢驗方法，通過對檢驗方法優(yōu)、缺點的探討，對硅藻檢驗中存在的問題、發(fā)展方向進行了討論分析，以期待對溺死鑒定有所幫助和借鑒。

關(guān)鍵詞：硅藻；溺死；分子生物學(xué)；DNA檢驗；掃描電鏡

硅藻檢驗被公認是一種可靠的檢驗方法，可為水中尸體死因診斷、入水地點及死亡方式判斷提供強有力依據(jù)。筆者長期工作于公安一線，本文從刑事偵查及法醫(yī)學(xué)的角度，綜述硅藻檢驗在法醫(yī)學(xué)溺死診斷中的發(fā)展與應(yīng)用，供同行借鑒。

1硅藻檢驗在法醫(yī)學(xué)溺死診斷實踐中的意義

1.1硅藻的生物學(xué)特性

硅藻是一種單細胞植物，其生物學(xué)特性，使其具有兩大特點：一是硅殼使硅藻不易受外界環(huán)境影響，可有效保存遺傳物質(zhì)；二是硅藻外殼紋路具有特異性，便于區(qū)分種屬。

1.2硅藻的法醫(yī)學(xué)檢驗史

19世紀末，人們開始對溺死尸體進行硅藻檢驗。1904年，Revenstorf發(fā)現(xiàn)了水中的浮游生物可以通過溺液進入肺臟。1937年Kasparek消化法奠定了基礎(chǔ)。1951年，Weinig和Pfanz創(chuàng)立單溴苯染色硅藻檢驗法。1950年起，Auer等[1]開始硅藻檢驗的定性、定量研究。硅藻檢驗的法醫(yī)學(xué)價值得到全球多個地區(qū)專家的認可，在溺死診斷中占有不可忽視的地位。

1.3硅藻檢驗的法醫(yī)學(xué)原理及意義

1.3.1死亡原因的推斷生前溺死者在溺死過程中因主動呼吸，硅藻隨溺液進入肺泡，并穿透毛細血管壁進入體循環(huán)，到達全身各器官，甚至骨髓。而死后拋尸入水者，因缺乏上述呼吸循環(huán)運動，硅藻有可能進入呼吸道甚至肺，但無法進入體循環(huán)。通過溺死和非溺死者體內(nèi)硅藻量的研究統(tǒng)計，二者有著明顯差異[2]。2018年，劉泉等[3]對100例大鼠溺死與死后入水進行對比，認為心、脾內(nèi)的硅藻含量均與水中硅藻濃度成正比，更適用于溺死診斷檢驗。

1.3.2落水位置的推斷硅藻的生長繁殖與環(huán)境中光照、溫度、水體成分、水流速度、環(huán)境pH值等因素息息相關(guān)，因此不同水域中的硅藻種類和含量有很大差異。Ludes[4]利用尸體中硅藻進行落水點推斷的研究，取得了成果，對案件性質(zhì)的推斷有著重要意義。

2硅藻檢驗方法

目前硅藻檢驗方法大致可以分為三類：消化法、化學(xué)元素法、DNA分子生物學(xué)檢驗法[5]。

2.1消化法

2.1.1無機消化法最初的硅藻檢驗方法有焚燒法、浸漬法、硅膠梯度離心法等[6]，主要通過簡單的焚燒或浸泡的方式檢測硅藻。1937年Kasparek創(chuàng)立濃硝酸法[7]，奠定了傳統(tǒng)無機消化法的基礎(chǔ)。此后，無機消化法進行了多次技術(shù)革新，從硝酸乙醇法[8]、硝酸乙醚法[9]，到濃硫酸濃硝酸過氧化氫法[10]，可以歸納為強酸加熱法，主要是在酸的種類、催化劑等方面進行改良，該類方法使硅藻檢出率大大提高，但存在一定危險性，對環(huán)境污染較大，因此該類方法已經(jīng)逐漸被替代。在上述強酸消化的基礎(chǔ)上，1988年李延閣研制出“破機罐”法[11]使硅藻檢驗技術(shù)進入儀器設(shè)備化新篇章。此后出現(xiàn)了以微波加熱+壓力可控密閉消解罐為原理的微波消解儀[12]，并以此為基礎(chǔ)設(shè)計了微波消解+掃描電鏡聯(lián)用法[13]，該方法使用了微波消解法和濾膜富集技術(shù)，使有機物消解更徹底，有效提高了硅藻的檢出率，是目前被廣泛使用的硅藻檢驗方法，但該法檢驗成本較高，檢驗周期長，且對技術(shù)人員的能力要求高，因此不易在基層推廣應(yīng)用，因此，王玉仲等[14]對濾膜進行透明化處理，可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察硅藻，有效降低了檢驗成本。

2.1.2有機消化法相對于無機消化法，有機消化法更加溫和，對硅藻破壞度低，能有效保留其核酸物質(zhì)，便于后續(xù)分子生物學(xué)檢測，但其消化能力有待進一步提高。有機消化法主要有Soluene-350消化法[15]及酶消化法[16]兩種。Soluene-350是一種含有四個銨離子的羥化物，其消化能力與強酸相當，但海水中的一些硅藻容易被Soluene-350消化，因此此法僅適用于淡水硅藻檢驗。此外，在Soluene-350消化法基礎(chǔ)上增加超聲波加熱程序可縮短試驗時間。利用蛋白酶K和SDS（十二烷基磺酸鈉）消化組織的方法稱為酶消化法，這一方法既可以檢測出硅藻，又可以檢出其他浮游生物，并且有效避免了強酸對硅藻的破壞。

2.2化學(xué)元素法

該方法主要通過紫外光激發(fā)水中浮游生物（包括硅藻）葉綠素a產(chǎn)生熒光，從而測算各器官中浮游生物含量，判斷水中尸體是否為溺死。此種檢驗方法操作簡單，污染小，成本低。但考慮到人體組織中其他熒光物質(zhì)會隨著尸體在水中浸泡的時間延長而增多，因此存在檢測結(jié)果假陽性率高的風險。2.3分子生物學(xué)檢驗方法2.3.116SrDNA、18SrDNA和SSU基因的檢驗1996年Kane等[17]通過PCR法從已知溺死尸體的組織中擴增出藍藻16SrDNA，以此證明藍藻可隨體循環(huán)進入各器官中。2008年何方剛等[18]利用Nubel設(shè)計的特異性引物，擴增了三個不同水域的DNA、兩種水域中溺死的實驗動物肺組織DNA，發(fā)現(xiàn)溺死動物肺組織基因片段與該水域組的特異性基因片段存在相關(guān)性，與無關(guān)水域組的基因片段存在差別，從而表明通過PCR-DGGE檢測法檢測16SrDNA可以為判斷溺死點提供依據(jù)。2017年，Zhao等[19]通過對18SrDNA的V7區(qū)域進行焦磷酸測序(PSQ)，確定不同硅藻的相應(yīng)分類群，進一步為推斷溺水位點提供依據(jù)。2013年，余政梁等[20]進行了動物實驗，通過檢測硅藻SSU片段，發(fā)現(xiàn)在溺死組動物組織中硅藻陽性檢出率遠遠高于非溺死組，認為該方法可以為溺死診斷提供有效依據(jù)。PCR-DHPLC法檢驗硅藻種類相對于消化法（如強酸-微波法）檢出率更高，降低了樣本的需求量。2.3.2葉綠素相關(guān)基因檢驗1）植物葉綠體1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基（ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase,rbcL）基因檢驗rbcL基因是植物葉綠體進行光合作用的關(guān)鍵基因片段，廣泛應(yīng)用于植物和藻類的分類研究。2012年，Kathleen等[21]設(shè)計針對硅藻rbcL基因特異性引物，用PCR-DHPLC法成功檢出各類較少見的硅藻種屬。2018年，彭帆等人[22]檢測了21種標準藻株、3種人體共生標準菌株和人類DN段，驗證引物特異性和靈敏性，同時與電鏡下硅藻檢驗做了對比，結(jié)果證明，基于rbcL引物建立的PCR檢測法能快速檢測硅藻rbcL基因，所需檢材量少。可見，檢測硅藻rbcL基因的方法，在溺死的推斷中應(yīng)用前景良好。2）纖細裸藻和肋骨條藻相關(guān)基因檢驗纖細裸藻（EuglenagracilisKlebs,EG）和肋骨條藻（SkeletonemaCostatum,SK）在各類水域十分常見，EG1、EG2、和SK1、SK2是葉綠素相關(guān)基因的表達產(chǎn)物，不存在于人體組織。2003年，Suto等[23]在溺死動物的肺、肝、腎中均檢出上述4種基因特異性DN段，為硅藻檢驗提供新方向。2008年，李小廷等[24]針對編碼EG1、EG2、和SK1、SK2相關(guān)基因，檢測溺死動物組織中的硅藻DNA，同時對比硝酸消化法檢測硅藻，結(jié)果證明通過檢測EG基因的方法檢出率要高于硝酸消化法，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3存在的問題及展望

3.1硅藻種屬的判斷

消化法聯(lián)合形態(tài)學(xué)觀察判斷硅藻種類準確度高，但消化法常對準確判斷存在諸多干擾，如無機消化法有可能會破壞硅藻形態(tài)，有機消化法有可能由于消化不完全掩藏硅藻形態(tài)，并最終導(dǎo)致部分硅藻種類遺漏。分子生物學(xué)檢驗方法中目的DN段較單一，靈敏度高，但較難提供準確硅藻種屬結(jié)果。如能尋找到特異性更高的基因片段，并建立更加全面的硅藻基因庫，則可為硅藻種屬判斷提供有效平臺。

3.2硅藻的定量

在實際硅藻檢驗中，各器官中的硅藻定量對于判斷死因是否為溺死至關(guān)重要，但目前的各種檢驗方式均存在不同的困難。以消化法中應(yīng)用較為普遍的強酸微波消解電鏡法為例，無機消化法對硅藻破壞嚴重，硅藻碎片常難以準確計數(shù)，且肉眼觀察計數(shù)存在無法避免的誤差，因此無法精確統(tǒng)計硅藻數(shù)量。而有機消化法常存在消化不完全的問題，導(dǎo)致部分硅藻計數(shù)的遺漏。如何在保證硅藻形態(tài)完整性的同時建立自動掃描計數(shù)機制有可能成為硅藻檢驗的下一步研究方向。分子生物學(xué)檢驗方法的定量統(tǒng)計存在的問題主要是操作過程中樣本的損耗。

3.3硅藻的DNA檢驗方法

分子生物學(xué)檢驗方法仍有較大發(fā)展空間：首先，硅藻DNA檢驗片段較為單一，且硅藻DNA目前大多停留在共性DNA的檢測水平上，缺乏種屬特異性的檢測，下一步可以探索和研究硅藻種屬特異性的檢驗方法，同時綜合使用其他溺死相關(guān)浮游生物的特異性引物進行探索，使所檢測浮游生物種類更豐富，結(jié)果更精確，為溺死診斷提供可靠證據(jù)。其次，溺死尸體多為腐敗尸體，DNA可能存在降解，改良硅藻DNA提取、純化方法，提高DNA檢出率亦是未來發(fā)展的方向之一。綜上，硅藻檢驗的意義毋庸置疑，雖然目前該應(yīng)用方法普遍存在成本高、對技術(shù)人員要求高、檢驗時間長、檢驗方法不成熟、環(huán)境污染等問題，但其已成為一種重要的技術(shù)方法，可為偵查辦案提供線索和證據(jù)，下一步還應(yīng)盡快完善該檢驗技術(shù)方法的行業(yè)標準，指導(dǎo)公安實戰(zhàn)。

參考文獻

［3］劉泉，陳軼群，柯技，等，生前溺死與死后入水SD大鼠心臟與脾臟內(nèi)硅藻檢驗的研究［J］.系統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2018(11):13-17.

［6］趙子琴.法醫(yī)病理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009:325-326.

［7］王會品.勒福特王水消解法檢驗硅藻的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

［8］王磊，王杰，王恩壽，等.非溺死尸體肺臟硅藻最大值在溺死鑒定中的應(yīng)用初探［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，1998,13(3):134-136.

［9］郭景元.現(xiàn)代法醫(yī)學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2000:388-390.

［11］李延閣，胡傳英.法醫(yī)用硅藻檢查破機罐的研制［J］.實驗室研究與探索，1998(6):94-95.

［12］孫維琦，于曉軍，李坦.微波消解法檢驗硅藻的實驗研究［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2002,18(3):175-176.

［13］胡孫林，溫錦鋒，張小婷，等.微波消解-掃描電鏡聯(lián)用檢測臟器內(nèi)硅藻［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2010,25(3):145-149.

［14］王玉仲，趙建，李鵬，等.三種硅藻檢驗方法比較［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,35(3):427-431.

［18］何方剛，黃代新，劉良，等.PCR-DGGE法檢測浮游生物16SrDNA在溺死鑒定中的應(yīng)用［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008(4):234-237.

［20］余政梁，劉超，胡孫林，等.PCR-DHPLC法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應(yīng)用［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2013(6):457-460.

［22］彭帆，劉超，徐曲毅,等.溺死相關(guān)硅藻rbcL基因檢測技術(shù)研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2018,43(1):98-102.

［24］李小廷，黃代新，林宇新,等.檢測浮游生物葉綠素相關(guān)基因診斷溺死的實驗研究［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008(3):151-156.

作者：劉萌妍 趙偉 趙怡 單位：北京市公安司法鑒定中心