梔子苷對流感病毒的抑制作用范文

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摘要

為探討梔子苷對甲型H1N1病毒的抑制效應(yīng)，進行了相關(guān)體內(nèi)外實驗研究。體外實驗中采用MTT法判定梔子苷對MDCK細胞的毒性作用。以帕拉米韋為陽性對照藥，根據(jù)MTT比色值，觀察梔子苷對甲型H1N1流感病毒感染的MDCK細胞的細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffects，CPE)，計算不同給藥方式(預(yù)防給藥、直接滅活及治療給藥)及不同藥物劑量干預(yù)下，梔子苷對甲型H1N1流感病毒的抑制效率;體內(nèi)實驗以甲型H1N1流感病毒感染ICR小鼠，建立甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎模型，比較梔子苷不同劑量干預(yù)下，小鼠肺指數(shù)、肺組織病理學(xué)檢查及小鼠存活率。實驗結(jié)果顯示，梔子苷的細胞毒性小，其TD50大于1040μmol/L;梔子苷在預(yù)防、直接滅活及治療給藥方式下，對甲型H1N1流感病毒感染的MDCK細胞抗病毒EC50分別為91.90、96.25和87.68μmol/L，對CPE有明顯抑制作用;梔子苷可顯著降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)、減輕肺組織炎癥損傷、降低小鼠死亡率、延長生存時間。實驗結(jié)果表明，梔子苷在體外能有效抑制甲型H1N1流感病毒對MDCK細胞的CPE，在體內(nèi)能有效保護甲型H1N1流感病毒對小鼠肺部的攻擊作用，可能為流感病毒的防治提供一個新的選擇。

關(guān)鍵詞

梔子苷;甲型H1N1流感病毒;細胞病變效應(yīng);抑制作用

2009年初，甲型H1N1流感病毒在北美地區(qū)爆發(fā)，隨后迅速蔓延至多個國家和地區(qū)［1］。近年來，小規(guī)模區(qū)域性H1N1流感流行病例仍有出現(xiàn)，該毒株已成為人際間傳播的主要流行性毒株之一。目前臨床上用于治療流感病毒感染的藥物主要有離子通道M2阻滯藥(金剛烷胺、金剛乙胺)和神經(jīng)氨酸酶抑制藥(扎那米韋、奧司他韋及帕拉米韋)。但由于流感病毒的自身易于變異的特點及其抗病毒藥物廣泛使用，耐藥毒株不斷出現(xiàn)，使之成為目前全球難以治療的病原［2－3］，因此，尋找并開發(fā)安全有效的抗流感藥物已迫在眉睫。我國中草藥自然資源豐富，品種繁多，從中尋找高效、低毒、廣譜的抗病毒成分，開發(fā)出能夠應(yīng)用于臨床防治流感的新型藥物很有意義。梔子苷(geniposide)系梔子提取物，為環(huán)烯醚萜苷類化合物，相關(guān)研究證實，其具有抗炎、抗氧化等生物活性功能［4－9］。為探討梔子苷對甲型H1N1病毒的抑制效應(yīng)，進行了相關(guān)體內(nèi)外實驗研究，旨在為其臨床防治流感病毒應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1細胞及病毒株馬丁達比犬腎上皮(Madin-Darbycaninekidney，MDCK)細胞，江蘇省疾病預(yù)防中心省級流感病毒參比實驗室保存株，傳代后使用。甲型H1N1流感病毒A/Jiangsu/1/2009(NT0901)，系江蘇省疾病預(yù)防中心省級流感病毒參比實驗室保存病毒株，復(fù)蘇后由流感病毒的MDCK細胞分離法分離培養(yǎng)，測得血凝效價為28。

1.2藥品和試劑梔子苷標準品(C17H24O10，Mr388.36，批號110749)購自中國食品藥品檢定研究院，純度≥97.5%。陽性對照藥物為帕拉米韋(C15H28N4O4，Mr328.41，批號H20130029)購自廣州南新制藥有限公司，體外試驗前用高純水配制成0.6μmol/L的母液，過濾除菌后備用。D-MEM培養(yǎng)液(含有L-谷氨酰胺)、0.25%Trypsin-EDTA胰酶、TPCK-胰酶、7.5%牛血清白蛋白組分V、青、鏈霉素母液、胎牛血清(FBS)、HEPES緩沖液、PBS液、DPBS液(美國Gibco公司);四甲基噻唑藍(MTT，上海怡成公司);二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)。細胞培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的DMEM溶液，細胞維持液則為不含血清，含有1%TPCK-胰酶的DMEM溶液。

1.3動物4～5周齡SPF級ICR雌鼠，體重為15±1g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2013-2016。

1.4儀器CO2培養(yǎng)箱(日本Yamato株式會社);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2方法

2.1病毒組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)滴定用病毒培養(yǎng)液將病毒進行1∶10稀釋成1×10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8、1×10－9、1×10－10共10個稀釋梯度。以每孔3×104接種MDCK細胞于96孔細胞板中，37℃、5%CO2孵育24h，至細胞長成單層后，棄細胞培養(yǎng)液，接種每孔100μL稀釋病毒液，每稀釋度設(shè)4孔，并設(shè)正常細胞對照組。每日觀察細胞形態(tài)，記錄細胞病變程度。判定細胞病變效應(yīng)(cytopathogeniceffect，CPE)指標:“0”表示無明顯病變，“1”表示CPE為l%～25%，“2”表示CPE為26%～50%，“3”表示CPE為51%～75%，“4”表示CPE為76%～100%，每孔隨機選擇10個視野，將各個視野的CPE進行累計后計算均值，判定該孔的CPE。依據(jù)《國家流感中心標準操作規(guī)程》［10］，72h后檢測病毒的紅細胞凝集滴度(HA，hemagglutination)，采用Reed-Muench法［11］計算出病毒的TCID50。

2.2藥物毒性測定將不同配比劑量的梔子苷分別加入細胞已長成單層的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1mL，每個劑量設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)正常細胞對照4孔，置于37℃、5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化(CPE法)，同時棄培養(yǎng)液上清液，每孔加入新鮮配制的含5mg/mL的MTT溶液50μL，繼續(xù)培養(yǎng)2～3h后，棄MTT上清液，以PBS液洗3次，每孔加DMSO150μL，輕搖5～10min，待紫色結(jié)晶完全溶解，以空白調(diào)零，自動酶標儀在570nm波長處測出細胞對照組和各實驗組的吸收度。以對照孔為參照，計算各實驗孔細胞的活力比值。

2.3MTT法測定CPE根據(jù)預(yù)試驗確定藥物濃度，梔子苷為260、130、65、32.5μmol/L，陽性藥帕拉米韋為0.3μmol/L。每個藥物濃度及正常細胞對照和病毒對照均設(shè)4孔細胞。病毒攻擊量為100TCID50。梔子苷干預(yù)分3組進行:預(yù)防給藥組，以含藥培養(yǎng)液預(yù)先與細胞孵育24h，再以NT0901感染細胞;細胞外直接滅活組，藥液與病毒液混合，置4℃作用24h后，加入細胞層;治療給藥組，以NT0901作用細胞2h后給予藥物，連續(xù)觀察3d，記錄各孔CPE。病毒對照組細胞病變達“4”，且細胞對照組無病變時，確定為MTT比色的最適時間點，進行比色，調(diào)節(jié)酶標儀吸收波長為570nm，讀取數(shù)據(jù)，計算病毒抑制率實驗重復(fù)3次。

2.4對小鼠流感病毒性肺炎的保護效應(yīng)60只小鼠隨機分成6組，每組10只。梔子苷試驗設(shè)3個劑量組，分別為5、10及20mg/kg，另設(shè)帕拉米韋對照組(劑量:30mg/kg)、病毒感染對照及正常對照組;梔子苷及帕拉米韋給藥方式為腹腔注射。小鼠予以3%水合氯醛麻醉后，除正常對照組予以無菌生理鹽水50μL滴鼻外，各組均予病毒液50μL滴鼻。感染后24h后藥物干預(yù)，連續(xù)給藥至第6天，稱重后處死小鼠，摘取全肺解剖稱重，計算肺指數(shù)［肺指數(shù)=(肺重/體重)×100%］;小鼠肺組織甲醛固定24h后，常規(guī)制成5μm石蠟切片，HE染色，觀察小鼠肺組織病理改變。為比較病毒攻擊后小鼠的存活情況，連續(xù)觀察12d，記錄小鼠體重變化及病死數(shù)。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0和GraphPadPrism6統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)以x珋±s表示，組間比較用t檢驗，多組資料比較采用ANOVA檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1病毒組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)依照國家流感中心標準操作規(guī)程［10］，根據(jù)紅細胞凝集試驗結(jié)果，以Reed-Muench法計算出流感病毒株NT0901的TCID50為10－4.5。

3.2梔子苷對MDCK細胞的毒性作用不同配比劑量梔子苷與MDCK細胞共培養(yǎng)72h后，MTT法對各實驗孔細胞活力進行測定并以對照孔為參照，計算各實驗孔細胞的活力比值。實驗顯示，在32.5～1040μmol/L濃度范圍各劑量梔子苷作用72h對MDCK細胞體外生長沒有明顯抑制作用(P＞0.05，圖1)。據(jù)此可以確認梔子苷對MDCK細胞的半數(shù)中毒濃度(TD50)大于1040μmol/L。根據(jù)此結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻［11－12］，本實驗在研究梔子苷對流感病毒抑制作用時，確定梔子苷和帕拉米韋的母液濃度分別為260和0.3μmol/L。

3.3梔子苷對CPE保護作用的形態(tài)學(xué)觀察病毒感染72h后，鏡下可見病毒對照組細胞腫脹變圓、萎縮、聚集、破碎融解等CPE現(xiàn)象;正常對照組細胞均貼壁生長，邊緣清晰、界限清楚、生長狀態(tài)良好;梔子苷預(yù)防、直接滅活及治療給藥3組細胞形態(tài)未見發(fā)生明顯變化;帕拉米韋組細胞亦未見明顯變化。病毒對照組、正常對照細胞組、梔子苷不同給藥方式組及帕拉米韋組的鏡下形態(tài)觀察見圖2(梔子苷和帕拉米韋各組皆為母液)。

3.4MTT法測定梔子苷對CPE保護作用感染72h后，依Reed-Muench法計算出梔子苷預(yù)防給藥、藥毒混合及治療給藥組的EC50分別為91.90、96.25和87.68μmol/L，帕拉米韋EC50為0.122μmol/L，各組數(shù)據(jù)詳見表1。根據(jù)MTT讀取的吸收度，計算出不同給藥方式、不同給藥濃度下梔子苷對NT0901的病毒抑制率。結(jié)果顯示，預(yù)防給藥、直接滅活及治療3種給藥方式下，梔子苷對NT0901致CPE保護作用隨藥物劑量的增加而增強，結(jié)果見圖3。

3.5梔子苷對NT0901感染小鼠后肺指數(shù)及存活率的影響在梔子苷及帕拉米韋干預(yù)小鼠NT0901肺炎第6天，各組的肺指數(shù)值結(jié)果顯示:梔子苷5、10、20mg/kg劑量組小鼠的肺指數(shù)值均顯著低于病毒組(P＜0.05)，但梔子苷3個劑量組間未見顯著差異，見圖4。小鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示(圖5):病毒對照組小鼠肺臟出現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎，支氣管、細支氣管壁及其周圍組織和小葉間隔等肺間質(zhì)充血水腫，正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，部分氣管腔內(nèi)可見滲出液及壞死組織，大量淋巴細胞、單核細胞在細支氣管壁及其周圍浸潤;梔子苷5mg/kg治療組炎癥反應(yīng)程度略輕于病毒對照組;梔子苷10、20mg/kg治療組與病毒對照組比較，其炎癥病理表現(xiàn)有明顯減輕，與帕拉米韋組比較炎性損傷程度大體相近。小鼠感染NT0901后，其活躍度逐漸降低，表現(xiàn)為抱團聚集、豎毛、反應(yīng)力下降等，病毒對照組于第4天開始出現(xiàn)死亡，至12d時小鼠存活率僅40%;梔子苷5mg/kg組小鼠于第5天開始出現(xiàn)死亡，至12d時存活率為60%;梔子苷10、20mg/kg組小鼠分別于第7天及第6天開始出現(xiàn)死亡，至12d時存活率分別為80%和70%，與陽性對照藥帕拉米韋組(存活率80%)基本接近。所有各干預(yù)組與病毒對照組比較皆有顯著差異(P＜0.05)，見圖6。

4討論

茜草科梔子樹的成熟果實梔子，藥食兩用，其性味苦寒，有清熱瀉火、清涼解毒的功效，長期以來應(yīng)用于熱病心煩、目赤腫痛、消化道出血及扭挫傷等的治療［13］，甚至對神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病亦有較好的治療作用［14－18］。本研究在體外實驗中將給藥方式分為3組，治療給藥方式是模擬人體感染流感病毒后，用藥物進行治療的過程;預(yù)防給藥方式則是模擬人體感染流感病毒前，用藥物進行預(yù)防的過程;藥毒混合作用組，則是試圖觀察梔子苷是否有直接滅活病毒的作用。藥物的跨膜轉(zhuǎn)運是藥物進入體內(nèi)過程的前提，也是其發(fā)揮活性所必需，貫穿藥物在體內(nèi)作用的整個過程。本研究結(jié)果顯示，3種給藥方式抑制甲型H1N1流感病毒的CPE作用都隨著藥物劑量的增加而增強，圖3表明同一劑量組下盡管給藥方式不同，但對甲型H1N1流感病毒導(dǎo)致的MDCK細胞病變均有較好的保護作用，3種給藥方式對病毒的抑制作用并無明顯差異。根據(jù)實驗結(jié)果可以初步推測:預(yù)防給藥時，可能是梔子苷與MDCK細胞表面相關(guān)膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而影響H1N1流感病毒與細胞的受體結(jié)合，國內(nèi)曾有研究［19］發(fā)現(xiàn)梔子苷可通過改善細胞膜流動性，維持細胞膜的正常功能來發(fā)揮抗流感病毒感染的作用，本結(jié)果與此研究結(jié)論有一定吻合;治療給藥時梔子苷對CPE抑制作用，可能與梔子苷一定程度上抑制病毒核酸復(fù)制或復(fù)制后轉(zhuǎn)錄有關(guān)，韓靜文等［20］研究認為梔子苷在MDCK細胞模型上表現(xiàn)為被動擴散，且不受P-糖蛋白的影響，還可能存在細胞旁路轉(zhuǎn)運;直接滅活給藥時，則有可能是梔子苷與H1N1流感病毒某些特定部位結(jié)合有關(guān)。盡管本研究結(jié)果提示3種方式皆有抑制CPE效應(yīng)，但其具體相關(guān)機制有待深入探究。

甲型流感病毒感染氣道上皮細胞后，單核-巨噬細胞被首先募集到感染附近激活，繼而啟動一系列炎性反應(yīng)，釋放前炎癥因子及炎性介質(zhì)，包括IL-1、6、8及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，而這些細胞因子能進一步激活損傷內(nèi)皮細胞、粒細胞及血小板等，釋放氧自由基、溶酶體酶等介質(zhì)，這些炎性介質(zhì)相互促進，形成逐級放大的“瀑布樣效應(yīng)”，結(jié)果導(dǎo)致廣泛的病理損傷，在肺部則表現(xiàn)為廣泛的炎性滲出及肺水腫［21］。肺指數(shù)是反映肺炎性滲出及實變程度的重要指標，本研究觀察到梔子苷治療組肺指數(shù)明顯低于模型組，與陽性藥帕拉米韋組相近。本研究結(jié)果表明，梔子苷能夠減少小鼠H1N1流感肺炎模型的死亡率，提示梔子苷對H1N1流感肺炎小鼠有顯著的保護效應(yīng)，推測梔子苷可能在體內(nèi)直接發(fā)揮了抗病毒作用，或是在保護小鼠病毒性肺炎的肺水腫及炎性因子“瀑布反應(yīng)”方面發(fā)揮了相應(yīng)作用。

總之，梔子苷在體外能有效抑制甲型H1N1流感病毒的CPE，在體內(nèi)則能有效保護甲型H1N1流感病毒對小鼠肺部的攻擊作用，初步表明其可能為流感病毒的防治提供一個新的選擇，但其具體機制尚待進一步探討。

作者：張耘實 祁賢 盧協(xié)勤 劉星 馮旰珠 單位：南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇省疾病預(yù)防控制中心 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科 南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科