病原菌生物學論文范文

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1材料與方法

1.1實驗方法

1.1.1病原菌的分離和致病性測定采集新近腐爛的百合鱗莖，采用組織分離法[11]在病健交界組織處切取4mm×4mm小塊，用75％酒精表面消毒30s，再用2%次氯酸鈉消毒7min，無菌水沖洗3次，然后置于PDA培養基上28℃黑暗培養，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進行純化，純化后的菌落再進行單孢分離培養。病原菌致病性測定根據柯赫氏法則，用滅菌的接種針在消毒后的鱗莖片上刺孔，將浸有菌液的濾紙片貼在孔上作為有傷接種，同時將浸有菌液的濾紙片貼在未刺孔的鱗莖片上作為無傷接種，將浸無菌水的濾紙片貼在孔上作為對照。接種處理完成后將鱗莖片置于培養皿中保濕培養，5d后觀察并記錄發病情況，確定病原菌對百合鱗莖的致病性。對接種發病的鱗莖片再次進行病原菌的分離。

1.1.2病原菌鑒定

1.1.2.1病原菌形態學觀察將病原菌接種到PDA平板，28℃黑暗培養2-5d，觀察菌落形態，并在顯微鏡下觀察病原菌的菌絲及孢子的形態特征，測量孢子大小。

1.1.2.2ITS序列分析將供試菌株接種于PDA培養基中；28℃恒溫培養4d，收集菌絲體，采用CTAB法提取病原菌基因組DNA。ITS通用擴增引物為TS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和TS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。擴增體系：50µL，基因組模板DNA1µL、10µmol/L上下游引物各1µL、2mmol/LdNTPs5µL、KODDNA聚合酶1µL、10×KODbuffer5µL，加ddH2O補足體積。PCR擴增反應程序為94℃預變性3min；94℃變性30s；58℃復性30s；72℃延伸3min，35個循環；72℃延伸10min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京信諾金達生物技術有限公司測序。所得測序結果在NCBI網站上用BLAST軟件進行同源性比較后，下載同源序列，用MEGA（molecularevolutionarygeneticsanalysis，Version6.0）軟件將病原菌ITS序列與同源序列進行比對，并采用鄰接法（Neighborjoining，NJ）構建系統發育樹，自舉法（bootstrap）對系統發育樹進行檢驗，500次重復。

1.1.3病原菌生物學特性將直徑5mm的病原菌菌塊分別接種于供試培養基平板（直徑9cm）中央，于培養箱中培養，分析培養基種類、碳源、氮源、溫度、pH和光照時間對病原菌菌絲生長和產孢量的影響。采用PDA、PSA、PMA、LA和LDA培養基；培養溫度分別為5、15、25和35℃；pH分別為5、6、7、8和9；全光照、全黑暗和光照/黑暗各12h；等量葡萄糖、果糖、乳糖和淀粉置換查氏基本培養基中的蔗糖，等量硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀和蛋白胨，置換查氏基本培養基中的硝酸鈉，并設空白對照。病原菌菌株Z1和Z2分別在以上各條件下培養5d、2d后（因菌株Z2生長速度較快，因此縮短培養時間統計菌落生長狀況），采用十字交叉法測量菌落生長直徑作為菌絲生長狀況指標，7d后采用血球計數板法測量孢子產量。

1.2數據分析

采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan氏新復極差法檢驗處理間差異顯著性。顯著水平p=0.05，每個處理3個重復。

2結果與分析

2.1百合鱗莖腐爛病癥狀及致病性蘭州百合鱗莖腐爛病的發生一般從鱗莖表面破損處開始，初侵染時在破損處形成略顯褐色的侵染點，逐漸擴展形成近圓形或不規則形狀的褐色病斑，病斑中央呈腐爛狀，并逐漸向四周擴大，病斑上可見灰綠色霉層，腐爛組織不斷增加，嚴重時導致整個鱗莖軟化腐爛。從蘭州百合鱗莖腐爛病斑上分離純化得到五株菌株，分別編號為Z1、Z2、Z3、Z4和Z5。致病性結果表明，僅菌株Z1、Z2單獨接種健康百合鱗莖片后，在接種部位出現腐爛病斑，并伴隨菌絲體大量繁殖，菌株Z2比Z1的侵染能力強，無傷接種也可導致鱗莖片腐爛（圖1-b、c）。菌株Z1和Z2混合接種鱗莖片后，使鱗莖片腐爛更為嚴重（圖1-d），其病癥與百合鱗莖自然條件下的發病癥狀相同。從接種發病部位可分別重新分離到與接種菌相同的菌株，表明所分離到的菌株Z1、Z2均為蘭州百合鱗莖腐爛病病原菌。

2.2病原菌鑒定

2.2.1病原菌形態從蘭州百合腐爛鱗莖上分離到的病原菌菌株Z1，在PDA培養基上菌絲質地致密絲絨狀，中央部分呈絮狀，菌株形成少量菌核，同時伴有滲出液（圖2-a）；菌落反面為無色至淡褐色，后期產生菌核時，會顯現黑褐色斑點（圖2-b）；分生孢子頭初為球形，后呈輻射形；分生孢子梗多生自基質，孢子梗200~800μm×8~20μm，壁厚，無色，粗糙；產孢結構為雙層；分生孢子為近球形，直徑為2.4~6.4μm，壁略粗糙（圖2-c）。病原菌菌株Z2在PDA培養基上生長迅速，菌絲疏松，最初呈白色，后變為灰黑色（圖2-d），菌落背面呈白色棉絮狀（圖2-e）；假根發達，分枝呈指狀或根狀，呈深褐色。孢子囊呈球形或近球形，初期呈白色，老后呈黑色，直徑25~200μm，孢囊孢子呈橢圓形或近球形，淡褐色（圖2-f）。

2.2.2ITS序列分析用ITS通用引物擴增出病原菌的通用引物序列，長度分別為594bp（GenBank登錄號：KP172534）和627bp（GenBank登錄號：KP172533）。經BLAST分析，菌株Z1、菌株Z2的rDNA-ITS序列分別與黃曲霉和米根霉的同源性最高。在同源性最高的序列中各挑選10個菌株的ITS序列分別與供試菌株構建系統發育樹。如圖3所示，菌株Z1序列與Aspergillusflavus（JF754467.1）的序列親緣關系最近，且與A.flavus相聚于同一群。如圖4所示，菌株Z2的序列與Rhizopusoryzae（JQ683242.1）的序列親緣關系最近，且與R.oryzae相聚于同一群。菌株Z1、Z2的ITS序列在NCBI上BLAST結果與A.flavus和R.oryzae的相似性為分別為99%和99%～100%，進而從系統分類學上進一步驗證了菌株Z1和菌株Z2；再結合病原菌的形態特征，可以確定菌株Z1為黃曲霉（A.flavus），菌株Z2為米根霉（R.oryzae）。

2.3病原菌的生物學特性

2.3.1培養基種類對病原菌菌絲生長和產孢量的影響A.flavus和R.oryzae兩種病原菌在供試的五種培養基上都能生長，兩種病原菌在百合培養基和百合葡萄糖培養基上菌絲生長和產孢量最大，且在這兩種培養基上的差異不顯著。A.flavus在LA上培養5d后菌落直徑達19.0mm，R.oryzae在LA上培養2d后，菌落直徑達40.5mm，7d后產孢量分別為10.35×106個/ml和8.06×106個/ml（圖5）。

2.3.2碳源、氮源對病原菌菌絲生長和產孢量的影響兩種病原菌對供試碳源均可利用。A.flavus在葡萄糖為碳源的培養基上菌絲生長速度最大，培養5d后菌落直徑達20.0mm，而在果糖、乳糖和淀粉為碳源的培養基上菌絲生長速度次之，且三者間差異不顯著。A.flavus在葡萄糖和果糖為碳源的培養基上產孢量最高，而兩者間差異不顯著；在淀粉為碳源的培養基上產孢量次之，在乳糖為碳源的培養基上產孢量最低（表1）。R.oryzae在葡萄糖和果糖為碳源的培養基上菌絲生長和產孢量最大，且兩者間差異不顯著；在乳糖和淀粉為碳源的培養基上菌絲生長和產孢量次之，且兩者間差異也不顯著（表1）。A.flavus在蛋白胨和硝酸銨為氮源的培養基上菌絲生長速度最大，且兩者間差異不顯著，但在蛋白胨為氮源的培養基上產孢量高于硝酸銨為氮源的培養基，在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養基上菌絲生長速度和產孢量都較低（表1）。R.oryzae在蛋白胨為氮源的培養基上，菌絲生長和產孢量都最大，在硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養基上菌絲生長較好，在硝酸銨為氮源的培養基菌絲生長較差，與無氮培養基差異不顯著，但在硝酸銨為氮源的培養基上產孢量高于硫酸銨和硝酸鉀為氮源的培養基（表1）。

2.3.3培養條件對對病原菌菌絲生長和產孢量的影響由表2可知，兩種病原菌的菌絲生長和產孢的最適溫度是25℃。A.flavus和R.oryzae在pH為5-9范圍內的PDA培養基上均能生長，A.flavus在pH為5、8和9的PDA培養基的菌絲生長速度均較快，5d后菌落直徑差異不顯著，而在pH為6時產孢量最大，7d后產孢量為9.85×106個。R.oryzae在pH為6時菌絲生長速度和產孢量最快，2d后菌落直徑達35.5mm，7d后產孢量為3.75×106個/ml：光照可促進兩種病原菌的菌絲生長和產孢，A.flavus在全光照條件下生長5d后，其菌落直徑達23.0mm，而R.oryzae在全光照條件下生長2d后，菌落直徑達24.0mm，7d后產孢量分別達13.03×106個/ml和6.33×106個/ml。

3討論

本研究通過致病性測定、形態學特性和ITS序列分析，確定引起蘭州百合鱗莖貯藏腐爛病的病原菌是A.flavus和R.oryza，表明此腐爛病害是根霉腐爛病和曲霉腐爛病混合發生，這兩種腐爛病害在百合鱗莖腐爛的相關研究中也有報道，但與本研究中分離到的病原菌不同，其病原菌是A.niger和R.stolonifer。此外，也有較多研究表明圓弧青霉菌、簇狀青霉菌也可導致百合鱗莖腐爛，我們在蘭州百合鱗莖貯藏病害調查時也發現大多腐爛嚴重的百合鱗莖表面著生有青霉菌菌絲，而且在分離病原菌時也分離到兩種青霉菌，但致病性測定表明，這兩種青霉菌均不引起百合腐爛，僅可在刺破表皮的百合鱗莖表面繁殖，表明我們分離到兩種青霉菌僅是腐生菌，而不是病原菌。

生物學特性研究表明，A.flavus和R.oryzae兩種病原菌的最適生長條件基本相同，這可能也是兩種菌可以共生而侵染百合導致其發生腐爛病的原因。此外，這兩種病原菌在LA和LDA培養基上的菌絲生長速度和產孢量均高于PDA和PSA（在LA和LDA上的菌絲生長速度和產孢量差異不顯著），表明百合鱗莖本身的營養有利于這兩種菌的繁殖而侵染百合鱗莖導致發生腐爛病害。目前，國內外食用百合的種植面積遠低于觀賞用百合，因此對百合鱗莖腐爛病的研究大多關注觀賞用百合鱗莖種球在生長發育過程中的腐爛對出苗率和花卉品質的影響，而尖鐮孢菌是引起觀賞用百合鱗莖種球腐爛的主要病原菌，這與導致蘭州百合鱗莖貯藏期間腐爛的病原菌不同，因此，防治花卉百合種球腐爛病的方法對食用百合也無借鑒作用。而作為食用的蘭州百合鱗莖在原產地的貯藏方式目前多采用低溫冷庫在零下4℃條件下貯藏，通常不采用其它防腐措施，導致貯藏期間腐爛病的發生較為嚴重，本研究通過對其病原菌的分離和生物學特性的研究，為下一步開展采用安全的方法消毒百合貯藏冷庫以及預處理百合鱗莖來防治腐爛病害的發生奠定了必要的基礎。

4結論

從蘭州百合腐爛鱗莖上分離鑒定得到黃曲霉和米根霉兩種病原菌。對這兩種病原菌的生物學特性研究表明,它們的最適生長條件相同，百合培養基和百合葡萄糖培養基最適宜菌絲生長和產孢，葡萄糖和蛋白胨為菌絲生長及產孢的最適碳源和氮源，最適生長溫度為25℃，在pH5-9范圍內都可生長，光照有利于菌絲生長和產孢。

作者：鞏慧玲孫愛潔李茜湯國綱袁惠君馮再平李善家單位：蘭州理工大學生命科學與工程學院甘肅集森片裝鮮百合有限公司