基因載體聚合物研究范文

本站小編為你精心準備了基因載體聚合物研究參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

非病毒基因載體聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等優點正成為目前基因治療的熱點之一。基因治療是一種將外源基因導入目的細胞并有效表達從而達到治療目的的方法,優良的基因傳遞系統要能包裹并保護核酸物質,避免內涵體降解,并能專一靶向機體的靶器官。載體問題一直是基因治療研究領域的核心技術之一,基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒等[1],其優點是病原性低、轉染率高,但其不僅價格昂貴,且易引發機體強烈的免疫反應并可能致癌,尤其是安全性低的缺點限制了其在臨床的應用。非病毒載體的種類很多,如陽離子聚合物、陽離子多肽和陽離子脂質體等[2],具有價格低、制備簡單、安全有效、無免疫原性等優點,已漸成為病毒類基因載體的替代者。本文從藥劑學的角度綜述近年來非病毒基因載體聚合物的研究現狀,并探討如何優化非病毒基因載體聚合物傳遞體系以提高基因治療的療效。

1非病毒基因載體的種類

1.1脂質體或脂質復合物

脂質體包括陽性、中性和陰性脂質體,其中陽性脂質體研究的最為廣泛。自從1987年以來,眾多學者相繼合成出許多陽離子脂質體。所有的陽離子脂質體的一端皆擁有1~2條由12~18個碳原子組成的疏水鏈,使其在水性介質中形成雙層結構,并包裹DNA;另一端為親水性的N+,通過靜電力與DNA結合以形成脂質復合物。構效關系研究表明[3],增加分子中N+數目以及N+與疏水鏈的距離,有利于基因轉移。脂質體或脂質復合物經靜脈注射后,很快被血漿清除并在肺組織中積蓄,蛋白質主要在肺內皮細胞中表達,通常表達時間較短,一般在給藥后4~24h即達峰,1周后消失。因此,陽離子脂質載體在治療一些肺部疾病如肺代謝性疾病、門脈高壓和急性呼吸窘迫綜合征等有較好前景。脂質體或脂質復合物也可直接應用于病變部位以避免靜脈給藥選擇性差的缺點。有研究表明[4],氣管內給予野生型Ad-p53凋亡誘導基因可促使肺泡上皮細胞中的半乳糖苷酶基因的表達使早期肺部腫瘤縮小,并且可有效地防止脂質復合物中DNA的降解。目前雖然在陽離子脂質體構效關系研究的基礎上,合成了一些新的脂質載體,但離理想的脂質載體還相距較遠,其主要困難在于體內外轉染條件的差別,而且轉染效果還取決于給藥途徑。因此,只有根據實際的臨床應用來個性化設計才能獲得較為理想的載體,這無疑給載體的開發帶來困難。脂質體或脂質復合物并沒有長期安全性報道。有動物實驗表明[5],脂質體或脂質復合物是無毒的,而且若給予小劑量,其誘導的炎癥反應很小;但當小鼠呼吸道吸入脂質復合物后,可誘導產生劑量依賴性的肺部炎癥反應并伴隨細胞因子的產生;若靜脈注射給予DNA陽離子脂質復合物,則發現可激發細胞因子如INF和TNF產生。這些細胞因子不僅引發毒性,還抑制外源基因的表達,影響療效。

1.2陽離子多聚物

1.2.1多聚賴氨酸聚-L-賴氨酸和去唾液酸糖蛋白連接的聚合物用于細胞的基因靶向轉移,其基因轉染效果較陽離子脂質體差。有研究表明[6],在有或無靶向配體的情況下,多聚賴氨酸與DNA的聚合物的細胞攝取率和基因轉染率都依賴于聚合復合物正電性的存在。而將組氨酸連接到聚-L-賴氨酸的殘基上形成的聚合物比添加了氯喹的聚-L-賴氨酸混合物更為有效,這可能是由于在pH<6的情況下,質子化的組氨酸提供了額外的內吞緩沖能力,因此,組氨酸的使用有助于避免DNA在吞噬細胞中被降解。此外,用半胱氨酸和色氨酸殘基替代聚-L-賴氨酸中的一些氨基酸殘基,會增強polyplexes的基因轉染率,這說明DNA的釋放可能受細胞內二巰鍵的還原所激發。雖然多聚賴氨酸像脂質體一樣能阻止血清中核酶對DNA的降解,但若經靜脈注射給藥,聚合物與血漿蛋白結合后仍將迅速從血漿中被清除。

1.2.2聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)PEI陽離子聚合物表面的正電荷與DNA上帶負電荷的磷酸基團產生靜電作用形成復合物。電鏡觀察顯示[7],復合物中的多數質粒DNA分子濃縮為孤立的環狀結構,DNA的二級及三級結構發生了改變,但一級結構無變化,仍保留轉錄活性。這種復合物的超分子結構可以描述為一種核-殼結構,疏水核是部分中和的DNA,外殼則是親水的陽離子聚合物鏈段。這種核-殼結構,增加了體系在血液循環中的穩定性,保護DNA在傳遞過程中不受DNA酶或巨噬細胞的降解。PEI陽離子聚合物由于其自身具有緩沖容量,在不需要加入吞噬細胞或溶酶體溶解劑的情況下就顯示出較好的基因轉染效果。PEI也具有細胞毒性作用,其毒性與相對分子質量(Mr)有關,不同Mr或異構體的PEI,在體內基因轉染的效果和毒性不同[8]。目前,PEI已用于不同給藥途徑的基因轉移如吸入、腎動脈內給藥、腦內注射和靜脈注射,如果在PEI的polyplexes偶聯上靶向配體將會增強其轉染能力。若用PEG包衣能使其在肺外組織、肝的基因表達增加,而且還能調節PEI的毒性,但是體外攝取有所降低[9]。而不論是靜脈注射,還是氣管內給藥,線形PEI的基因表達皆優于陽離子脂質體。

1.2.3樹突狀聚合物樹突狀聚合物系一定Mr范圍的聚酰胺和含磷樹狀聚合物的末端氨基通過靜電力與DNA結合形成的一種陽離子多聚物非病毒基因載體[10],聚酰胺樹狀聚合物的酰胺鍵在水或乙醇中的水解,可使基因轉染率增加50倍,其原因可能是水解增加了聚合物的柔韌性。故一些可水解的聚酰胺樹狀聚合物對體內頸動脈的基因轉染比支鏈PEI更有效。Kurtoglu等[11]研究了樹突狀聚合物的載藥特性,結果表明增加末端氨基的數目能增加聚合物基因轉染的效果,并且還發現,水解的聚酰胺樹狀聚合物對吞噬細胞的膨脹作用至關重要。

1.3殼聚糖載體聚合物

殼聚糖作為一種天然陽離子聚合物,通過與DNA以靜電方式作用使殼聚糖-DNA體系不被降解,完全進入細胞。作為基因載體,殼聚糖具有細胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和轉染效率較高等特點[12]。研究者對殼聚糖-DNA復合物的制備及其生物活性進行了大量研究。殼聚糖-DNA復合物按制備方法主要分殼聚糖及其衍生物的DNA復合物、殼聚糖-DNA納米微球和殼聚糖自聚體-DNA。有研究表明[13],殼聚糖的Mr、DNA復合物的N/P值、DNA復合物顆粒大小和對殼聚糖的改性及其改性程度是影響這類DNA復合物對細胞的轉染效率和是否對特定細胞具有靶向性的主要因素。殼聚糖載體對質粒DNA有效的凝聚作用和保護DNA不被核酸酶降解是其它高分子載體無法比擬的。

1.4無機納米粒子載體

應用于基因轉運的無機納米粒子主要包括硅、鐵氧化物、碳納米管、磷酸鈣、金屬納米粒子、量子點等。無機納米粒子主要通過穿過細胞膜將藥物或生物分子轉運到生物體中而起到治療疾病的作用,其發揮轉染功能的大致過程有:首先,將DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面,通過內吞入胞等方式被轉運至細胞內并且被釋放。其次,將DNA導入細胞核并發揮功能。一般來說,分子都是通過核孔復合物進入細胞核。核孔復合物是一個插入到雙層核膜中的蛋白質大分子,允許大約9nm的溶質自由通過。生物大分子或納米粒子通過核孔則需要信號介導的轉運分子。但目前沒法確定DNA進入細胞核的確切途徑,學者們主要傾向于兩種主要理論:一種是納米粒子在內涵體或細胞質中被溶解,然后釋放DNA轉運進核;另一種是攜帶DNA的納米粒子直接到達細胞核表面,然后DNA轉運進核。雖然無機納米粒子的材料不同,但其具有濃縮及保護DNA的作用、較大的核酸裝載容量、優良的表面性質、極低的免疫原性[14]都賦予了其在基因轉染領域巨大的應用潛力。

2非病毒基因載體聚合物傳遞體系的優化

大多數非病毒基因傳遞系統的體外基因傳遞過程如下[15]:細胞內吞、脫離溶酶體、基因DNA進入細胞核。理想的非病毒基因載體聚合物傳遞體系能在體內循環系統中保持穩定,有效地到達靶向細胞,并實現在靶向細胞內的高效安全表達。通過對傳遞體系的優化,可提高其在體內循環中的穩定性、延長作用時間、減少細胞毒性及提高靶向性,從而提高基因傳遞體系的轉染率。

2.1原位交聯非病毒基因載體聚合物傳遞體系

在生理環境中,多數非病毒基因載體聚合物易聚集,很快從體內循環中清除,因而限制其應用。分子生物學的研究表明,病毒基因載體聚合物能保持穩定的原因為蛋白質大單體的交聯。因此,可以通過聚陽離子交聯制備非病毒基因載體聚合物傳遞體系,以提高其在鹽溶液中的穩定性。對于兩親嵌段共聚物/DNA在水溶液中形成的膠束進入血液循環系統時,被高度稀釋,如濃度降低到臨界聚集濃度時,膠束就會解體。通過嵌段共聚物間的交聯可有效抑制膠束的解體。PEG-b-PLL是最早采用戊二醛作為交聯劑的體系,以戊二醛為交聯劑,雖然提高了膠束的穩定性,但卻增加了其毒性。Han等[16]則在PEG-b-PLL中引入-SH,通過-SH間的交聯反應穩定膠束。這類原位交聯的超分子組裝基因載體極大地提高了基因傳遞體系在鹽溶液中的穩定性。

2.2兩親性非病毒基因載體聚合物傳遞體系

絕大多數聚陽離子/DNA聚合物在生理環境下的溶解度很小,易沉析出來。通過在聚陽離子中引入親水鏈段(如PEG)合成兩親嵌段或接枝共聚物,作為非病毒基因載體可有效地改善溶解性和細胞毒性問題。

兩親共聚物包括聚陽離子鏈段和非離子的親水性鏈段。這類共聚物的合成通常采用兩種方法,一是以端基功能化的親水鏈段作為大分子引發劑,引發陽離子鏈段的聚合;二是聚陽離子鏈段和聚親水鏈段的偶合反應。Wang等[17]采用前一種方法合成了一系列的兩親嵌段聚合物。非離子鏈段要求鏈段柔順、低毒性以及低免疫原性,PEG最常被共價連接到陽離子聚合物上。由于PEG具有很強的水合作用,延長在血液循環中的時間,提高靶向細胞的吸收,且PEG鏈端也可引入各種功能基團,因而兩親嵌段聚合物是最常用的一類聚合物。聚陽離子鏈段的結構對基因轉染效率有很大的影響,如電荷的密度、鏈的柔順性以及疏水性都會影響與基因分子的作用,從而影響復合物的穩定以及解離。兩親共聚物/DNA聚合物的尺寸、結構及物理化學性質影響相關基因傳遞體系的體外、體內性質。ζ電位是關系到聚合物穩定性的一個重要參數[18],ζ電位與聚陽離子/DNA的比例有關。由于細胞膜表面為負電荷,ζ電位為正的基因傳遞體系,有利于細胞的內吞,因此在體外基因轉染實驗中,通常在陽離子聚合物過量的條件下制備基因傳遞體系。通過調節兩親共聚物的結構和基因載體的制備條件,就可獲得有良好溶解性、穩定性及高基因轉染率的兩親共聚物/DNA的非病毒基因載體聚合物。

2.3配體增強型非病毒基因載體聚合物傳遞體系在保證治療基因作用的前提下盡量減少給藥劑量,可避免很多不良反應。目前,提高基因傳遞體系的靶向性主要是通過在非病毒基因載體聚合物中引入與靶向細胞表面富含的受體或蛋白特異性結合的配體,制備配體增強型的非病毒基因載體聚合物傳遞體系。如半乳糖苷配體能與肝細胞膜表面的唾液酸糖蛋白受體特異性結合并介導內吞;而葉酸能與癌細胞表面的受體特異性識別,在基因治療中常作為癌細胞的靶向配體。配體的引入有兩種方法:一是采用分子偶聯方法將配體共價鍵合到脂質體或陽離子聚合物上;二是在聚陽離子/DNA聚合物中引入含特異性配體的第三組分,使之作為涂層分布于基因傳遞體系的表面。蔣建偉等[19]將糖基共價連接到PEI中(Gal-PEI),從而使外源DNA導入肝細胞中并實現表達。但透射電鏡顯示在生理環境下,Gal-PEI/DNA聚合物易發生集聚,限制了其的應用。

3結語

目前,基因治療已成為醫藥科研中最活躍的研究領域。藥劑工作者的首要任務就是設計開發出無毒、高效的基因治療載體。目前,非病毒基因載體聚合物以其低毒、低免疫原及靶向性等優點正在逐漸代替病毒基因載體,但基因轉染率仍然較低,因此,設計既具有病毒的優點,又能克服病毒的細胞毒性和免疫原性人工病毒基因傳遞系統勢在必行。未來的基因傳遞系統將被設計得更像病毒,具有多功能的基因載體聚合物。隨著高效、安全、靶向的基因傳遞體系的研究開發,基因治療必將得到越來越廣泛的應用。