多糖方法范文

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1多糖的發展歷史及其發展方向

多糖是由多個單糖基及糖苷鍵相連接而成的高聚物，一般是20個以上的單糖聚合而成，廣泛存在于動物細胞膜，高等植物和微生物的細胞壁中，是構成生命的四大基本物質之一，同維持生命活動密切相關。蛋白質、核酸和多糖最重要的三種生物大分子，由于多糖的結構難以控制比蛋白質和核酸復雜得多，再加上人們早期只把多糖看作細胞結構成分和食物來源，使得人們對多糖的研究成為“生物化學中最后一個前言”。如100多年前，德國著名科學家就開始了糖類的研究。目前，以多糖結構、功能和藥用價值為核心的糖工程被認為是繼蛋白質工程、基因工程后生物化學和分子生物學領域中最后一個巨大的科學前沿。

目前，世界各國政府對多糖的生物學研究給予高度重視。1986年美國能源部資助佐治亞大學創建了復合糖研究中心，建立復合糖數據庫。牛津大學Dwek教授在1988年提出糖生物學這個名詞，這標志著糖生物學這一新的分支學科的誕生。日本于1989年創辦了《糖科學與糖工程動態》雜志，出版了專著《糖工程學》。同年日本政府科學技術廳提出“糖工程基礎與應用研究推進戰略”。1990年E-選凝素的發現將糖生物學推向了生命科學的前沿。歐盟于1994-1998年發起“歐洲糖類研究開發網絡”計劃。糖生物學的時代正在加速來臨，甚至有人預計，如同20世紀，蛋白質、膚類、氨基酸與核酸時代一樣，21世紀應當是多糖生命科學的時代。

糖類的研究工作和蛋白質、核酸的研究工作相比，在我國還是一個薄弱的環節。我國在多糖方面的研究始于20世紀70年代，但近年來發展迅速，在全國第一次糖的生化學術會議后，《糖復合物的生化研究技術》出版，標志著我國在糖化學方面的研究工作已經有了一個較好的開端網。1996年我國將“糖生物學”列為國家重點課題。研究的對象包括植物類、動物、真菌類、細菌、地衣等；研究范圍涉及多糖的分離純化、理化性質、結構分析、免疫學、藥理學以及臨床應用等，其中對免疫提高作用機理的研究已經深入到分子、受體水平；研究的方法涉及化學、物理、生物學、醫藥學等諸多領域。我國地大物博，糖類資源也很豐富，而且有些真菌多糖還對生物體具有獨特的生理作用，可以作為藥用資源。

今后一個時期內，多糖的研究有以下幾個趨勢：從單味中藥多糖的研究向中藥復方多糖體系的研究發展；從單一免疫系統作用的研究向神經內分泌免疫網絡作用的研究發展；從藥品向食品、從治療向保健發展。經過半個多世紀的發展，活性多糖的研究取得了重大進展。建立了一系列活性多糖的提取、純化方法、生物活性測試方法、結構分析方法，發現了許多具有重要生理活性的多糖，研究的廣度和深度在不斷發展。隨著多糖化學和糖生物學的深入研究，活性多糖將會進入一個新時代，將為人類的健康和安全提供更為有力的幫助。

2多糖的研究方法

2.1多糖的來源

多糖來源十分豐富，廣泛存在于動物、植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中（如植物的種子、莖和葉，動物粘液，昆蟲及甲殼動物的殼真菌，細菌的胞內外等），從動植物器官組織、菌類及微生物發酵產物中可得到不同種類的多糖。按其來源可分為高等植物多糖、動物多糖、微生物多糖、藻類多糖。其中研究較早且最多的是從細菌中得到的各種莢膜多糖，它在醫學上主要用于疫苗。1984年，蘇聯人在荷蘭召開的第十二次國際碳水化合物討論會上報道了用合成特定結構的莢膜多糖作疫苗，引起與會者的極大興趣，此后有關真菌多糖的研究逐漸深入和廣泛，如酵母菌多糖、食用菌多糖，特別是食用菌多糖的研究，取得了很大進展，其中以香菇多糖研究的較為深入。1969年，日本人千原首次報道從香菇中分離出一種抗腫瘤多糖，轟動了整個醫學、藥學界，之后掀起一股從食用或藥用真菌中尋找抗腫瘤成分的熱潮。另外，植物多糖的開發也倍受人們的青睞，由于我國是中藥的起源之地，而糖類是中藥材中普遍存在的成分，在對各種中藥材的化學成分研究的過程中，人們都少不了對其中多糖的關注。植物多糖研究得比較深入的是稻草多糖、麥秸多糖、竹多糖、刺五茄多糖。海藻多糖雖然研究得不多，但其前途也是很光明的。到目前為止，已有300多種多糖化合物從天然產物中被分離出來。

2.2多糖的提取、分離純化

2.2.1多糖的提取

多糖是極性大分子化合物，常用的提取方法有：熱水浸提法、稀堿浸提法、酸浸提法和酶法。前三種為化學方法，酶法為生物方法。稀酸提取時，時間宜短、溫度不宜超過50℃。一般植物多糖提取多采取熱水浸提法。在提取多糖之前，首先要根據多糖的存在方式及提取部位的不同，決定在提取之前是否作預處理。動物多糖和微生物的細胞內多糖的組織細胞多有脂質包圍，一般需先加入醇或醚進行回流脫脂，釋放多糖，然后依多糖性質（如酸堿性、胞內或胞壁多糖）再將脫脂后的殘渣采用以水為主體的溶劑（冷水、熱水、稀鹽或稀堿水、或熱的稀鹽或稀堿水）等溶液提取。溶劑性質、浸提溫度、時間等均影響提取效果。現在，提取多糖還多采用酶法，常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶及其復合酶。

2.2.2多糖的分離

采用以上方法提取的多糖中常含有無機鹽、大分子蛋白質、木質素、色素及醇不溶的小分子有機物等雜質，必須分別除去，將這些雜質除去的過程，一般稱為多糖的分離。工業化生產中一般采取透析法、離子交換、凝膠過濾或超濾法除去這些雜質。對于大分子雜質，可用酶法、乙醇、丙酮溶劑沉淀法或絡合物法除去。

脫蛋白質.

由于原料組成中均含有一定量的蛋白質，因此在多糖的提取工藝中，脫除蛋白質是分離多糖的重要步驟。常用的方法有：Sevag法，三氟三氯乙烷法，三氯乙酸法，酶法或酶法與Sevag法結合，等電點沉淀法。

Sevag法，利用蛋白質在氯仿中變性的特點，用氯仿：戊醇=5：1或4：1的二元溶劑體系按1：5加入到多糖提取液中，混合物經劇烈振搖后離心，蛋白質與氯仿-戊醇生成凝膠物而分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此法條件溫和，但是效率不高，一般要脫除5次左右方可除盡蛋白質。酶法或酶法與Seveg法結合，用蛋白酶將蛋白質水解，再通過透析、凝膠過濾或超濾除去，是目前認為較好的脫蛋白質的方法。

三氟三氯乙烷法，將三氟三氯乙烷按1：1的比例加到多糖提取液中，在低溫下攪拌約10min，離心得上層水層，水層繼續用上述方法處理幾次即得。此法效率高，但因溶劑沸點低，易揮發，不能大量使用。

三氯乙酸法，利用三氯乙酸沉淀蛋白質的原理，用3%-30%三氯乙酸，在低溫下攪拌加入到多糖提取液中，直至溶液不再繼續混濁為止離心棄沉淀，即可達到脫蛋白的目的。存在于溶液中的三氯乙酸經中和后，通過透析或超濾等方法除去。此法較為劇烈，會破壞含呋喃糖殘基的多糖但效率高，操作簡單，植物多糖多采用此法。

等電點沉淀法，逐步調節粗糖溶液pH至酸性（PH=2-5），可以有效除去大部分酸性蛋白質。其優點是適合于工業化生產，為防止在酸性條件下某些基團或糖普鍵被破壞，宜在低溫下進行。

脫色

對于植物多糖可能會含有酚類化合物而顏色較深，而從動物和微生物等中提取的多糖也會帶有不同深淺的顏色，對多糖進行脫色處理可使多糖的應用范圍更加廣泛。常用的脫色方法有：離子交換法、氧化法、技術絡合物法、吸附法（纖維素、硅藻土、活性炭等）。一般情況下，可以用活性炭處理脫色，但活性炭會吸附多糖，造成多糖損失。DEAE-纖維素是目前最常用的脫色方法，通過離子交換柱不僅達到脫色目的，而且可以進行多糖的分離。H2O2作為一種氧化脫色劑，濃度不宜過高且在低溫下進行，否則會引起多糖的降解。

2.2.3多糖的純化

上述經過脫蛋白、脫色和去除小分子雜質的提取液是含多種組分的多糖混合物，即是多分散性的。其不均一性表現在化學組成、聚合度、分子形狀等的不同。要得到單一的多糖組分，還需要進行純化。通常采取的純化方法有以下幾種。

（l）分級沉淀法

利用不同分子量的多糖在不同濃度低級醇或低級酮中的溶解性不同的原理，逐步提高溶液中醇或酮的濃度，使不同組分的多糖依分子量由大至小的順序分級沉淀可達到純化的目的。

（2）季銨鹽沉淀法

根據長鏈季銨鹽能與酸性多糖形成不溶性多糖化合物的特性，以分離酸性和中性多糖常用的季銨鹽是十六烷基三甲基嗅化錢（CTAB）及其堿（CTA-OH）和十六烷基吡啶（CPC）。實驗時應嚴格控制多糖混合物的pH值小于9且無硼砂存在，否則中性多糖也會沉淀出來。通常CTAB或CPC水溶液的濃度為1%-10%（W/V），在攪拌下滴加于0.1-1%（W/V）的多糖溶液中，這時酸性多糖即能從中性多糖中沉淀出來。根據形成的沉淀能溶于不同的鹽溶液、酸溶液和有機溶劑中的性質，使多糖游離出來。

（3）離子交換層析法

利用不同多糖分子電荷密度不同，而與離子交換劑中的離子或某些基團發生電性結合。其親和力隨多糖結構與電離性質而異，一般隨著分子中酸性基團的增加而增強，線狀分子、分子量較大的多糖親和力較強，支鏈多糖較直鏈多糖更易吸收。常用的離子交換劑有樹脂類、纖維素類和葡聚糖類。陰離子交換柱層析法適用于各種酸性、中性多糖和糖胺聚糖的分離純化。在pH6.0時，酸性多糖能吸附于交換介質上，中性多糖不能吸附，然后用pH相同但離子強度不同的緩沖溶液將酸性強弱不同的酸性多糖分別洗脫下來，但如果柱子為堿性，則中性多糖也能吸附。但中性多糖不能與硼砂形成絡合物，所以可將柱子處理成硼砂型的，用不同濃度的硼砂溶液洗脫，也能將不同的中性多糖分離開來。檢測手段一般沿用苯酚-硫酸法，也常用LKB柱層析系統，用比旋光度、示差折光及紫外檢測器，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。

（4）凝膠柱層析

常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex）、瓊脂糖凝膠（Sepharose）以及Sephacryl。以不同濃度的鹽溶液和緩沖液作為洗脫劑，其離子濃度不低于0.02mol/L，通過凝膠柱層析多糖可分為不同分子大小的糖。本法除進行多糖分級外，還可以用于小分子雜質的去除，或者在乙醇沉淀法進行分級后，再根據分子大小進一步分級。

（5）鹽析法

根據不同多糖在不同鹽濃度中具有不同溶解度的性質，加入不同鹽析劑使不同多糖逐步析出，常用的鹽析劑有NaCI、KCl和（NH4）2SO4等，其中以（NH4）2SO4效果最佳。

（6）其他方法：利用不同多糖分子大小、形狀及電荷不同而在電場作用下達到分離目的的制備性電泳，分離效果較好。用己知超濾膜分離不同形狀與分子量大小的多糖的超濾法，以多糖與抗血清產生選擇性沉淀為原理的親和層析法，以及具有快速高效特點的制備性高效液相層析法，已有效的應用于小規模純品制中。此外，多糖的分級純化方法還有凍融分級和超速離心等方法。