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番瀉葉(Foliumsennae)為中國(guó)藥典2005年版一部收載的常用瀉下導(dǎo)滯藥之一，為豆科植物狹葉番瀉(CassiaangustifoliaVahl)或光葉番瀉(C.acutifoliaLelile)的干燥小葉[1]。
番瀉葉味甘、苦，性寒，有瀉熱行滯、通便的功能。主要用于治療熱結(jié)便秘、積滯腹脹。近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)番瀉葉可治療流行性出血熱、急性胰腺炎及中毒性腸麻痹等[2，3]。本品長(zhǎng)期以來(lái)依靠進(jìn)口，主要進(jìn)口國(guó)是印度。20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)在海南、廣西等省引種成功，但商品售價(jià)僅為進(jìn)口的1/3～1/2。國(guó)產(chǎn)番瀉葉外觀、性狀、顯微特征與進(jìn)口商品無(wú)明顯差異，但其有效成分的多寡和活性如何還需要進(jìn)一步研究。為此我們課題組從化學(xué)成分、活性成分的定性定量以及藥理作用等多方面進(jìn)行一系列的比較研究。現(xiàn)將兩種商品番瀉葉提取物對(duì)小鼠排便和腸蠕動(dòng)作用的比較及由國(guó)產(chǎn)番瀉葉制備而得的番瀉總苷提取物的雌性激素樣抗骨質(zhì)疏松作用的結(jié)果報(bào)告如下。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1動(dòng)物：健康昆明種小白鼠，體重(20±2)g，雌雄兼用。進(jìn)行雌性激素樣抗骨質(zhì)疏松作用研究時(shí)僅用雌性小鼠。由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供。
1.1.2藥材：藥材A，產(chǎn)于我國(guó)海南省陵水地區(qū)，總番瀉苷以番瀉苷B計(jì)算為2.30%。藥材B，印度進(jìn)口，中華人民共和國(guó)進(jìn)口藥材批件受理號(hào)為：JZC2003292；天津藥品檢驗(yàn)所進(jìn)口藥品檢驗(yàn)報(bào)告書(shū)編號(hào)為：20040112/13；檢驗(yàn)結(jié)果含總番瀉苷以番瀉苷B計(jì)算為2.50%，收驗(yàn)日期：2004-09-02。兩者經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院路金才副教授鑒定均為豆科植物狹葉番瀉（CassiaangustifoliaVahl）的干燥葉。
1.1.3試劑：含碳末的生理鹽水，含碳末0.1g/ml；含50%墨汁（5%炭末，10%阿拉伯膠制成的混懸液）生理鹽水；乙醇；己烯雌酚；苦味酸染色劑。DA101大孔吸附樹(shù)脂（遼寧鑫泰）。
1.1.4儀器：超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器；電子分析天平（MettlerAB204-A上海）；冷凍干燥儀；計(jì)時(shí)器；注射器。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1供試樣品的制備
1.2.1.1樣品制備原則：活性物質(zhì)采用國(guó)際上通用的兩種溶劑即乙醇和水提取制備[4]，乙醇的濃度根據(jù)文獻(xiàn)采用65%[5]。
1.2.1.2乙醇提取：分別取藥材A和藥材B各100g，各加65%乙醇1500ml浸漬30min后超聲提取：超聲功率為80%，超聲溫度為20℃，超聲時(shí)間為10min。減壓回收乙醇各制成含生藥2.0g/ml。標(biāo)記為：A-e（國(guó)產(chǎn)番瀉葉乙醇提取物），B-e（印度進(jìn)口番瀉葉乙醇提取物）。
1.2.1.3水提取：分別稱取藥材A和藥材B各100g，分別加蒸餾水1500ml浸漬30min后超聲提取：超聲功率80%，超聲溫度20℃，超聲時(shí)間10min。減壓濃縮各制成含生藥2.0g/ml。標(biāo)記為A-w（國(guó)產(chǎn)番瀉葉水提物），B-w（印度進(jìn)口番瀉葉水提物）。
1.2.1.4番瀉總苷提取物制備：稱取藥材A100g，用65%乙醇加熱回流提取，減壓回收乙醇，調(diào)pH至7～8，通過(guò)DA101大孔吸附樹(shù)脂純化，流出液經(jīng)冷凍干燥即得。臨用前配成含生藥2.0g/ml的溶液。
1.2.2對(duì)小鼠排便的影響[6]：取禁食24h小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只，用苦味酸標(biāo)記。各給藥組動(dòng)物分別灌服A-e、B-e、A-w、B-w番瀉葉提取物的碳末混懸液（含碳末0.1g/ml），對(duì)照組給予生理鹽水碳末混懸液（含碳末0.1g/ml），給藥容積0.3ml/10g。給藥后，每組小鼠分別置于鋪有濾紙的安鐘罩內(nèi)進(jìn)行觀察，記錄小鼠首次排黑色糞便的時(shí)間、糞便數(shù)量，并觀察糞便性狀以及糞便沾染肛門(mén)的情況，連續(xù)觀察6h。
1.2.3對(duì)小鼠腸蠕動(dòng)的影響[6]：取禁食24h小鼠75只，隨機(jī)分為5組，每組15只，用苦味酸標(biāo)記。各給藥組分別灌胃A-e、B-e、A-w、B-w四種供試樣品（含50%墨汁），對(duì)照組給予含50%墨汁的生理鹽水，給藥容積為0.3ml/10g。給藥后30min脫頸椎處死。打開(kāi)腹腔分離腸系膜，剪取上端至幽門(mén)，下端至回盲部腸管，置于托盤(pán)上。輕輕將小腸拉成直線，測(cè)量腸管的長(zhǎng)度作為小腸總長(zhǎng)度，從幽門(mén)至墨汁前沿的距離作為墨汁在腸內(nèi)推進(jìn)的距離。利用如下公式計(jì)算墨汁推進(jìn)的百分率，并注意觀察各組小腸容積是否增大。墨汁推進(jìn)率（%）＝墨汁在腸內(nèi)推進(jìn)的距離/小腸全長(zhǎng)×100%。
1.2.4雌性激素樣抗骨質(zhì)疏松作用研究[7,8]：將小鼠按體重隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、模型對(duì)照組、番瀉總苷低劑量組（低劑量組，3.0mg/kg）、番瀉總苷高劑量組（高劑量組，6.0mg/kg）、己烯雌酚組（2.0mg/kg），每組15只。假手術(shù)組行雙側(cè)卵巢摘除假手術(shù)，另4組行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后5d開(kāi)始做陰道涂片，在給藥過(guò)程中每天做小鼠陰道涂片觀察動(dòng)情期出現(xiàn)情況。以灌胃方式給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥49d，對(duì)照組給予等體積蒸餾水。于末次給藥24h后自眼眶取血，分離血清，測(cè)血鈣、血磷和降鈣素的含量，記錄小鼠體重、副性器官子宮重和左側(cè)股骨重，計(jì)算臟器系數(shù)。
1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)處理使用SPSS12.0軟件，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)。
2結(jié)果
2.1國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口商品番瀉葉提取物對(duì)小鼠排便的影響（見(jiàn)表1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察了小鼠糞便的性狀，對(duì)照組為成形的濕軟的小棗狀，各給藥組均為不成形的稀便。
2.2國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口商品番瀉葉提取物對(duì)小鼠腸蠕動(dòng)的影響（見(jiàn)表2）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察了腸容積的變化，除對(duì)照組不變外，其他組均明顯增大。
2.3番瀉總苷對(duì)去勢(shì)雌性小鼠動(dòng)情周期的影響（見(jiàn)表3）結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與假手術(shù)組間有顯著性差異（P<0.01），與模型對(duì)照組比較，番瀉總苷高低劑量組均可明顯縮短去勢(shì)小鼠動(dòng)情周期（均P<0.01），表明番瀉總苷具有雌性激素樣作用。且番瀉總苷高劑量組與己烯雌酚組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
2.4番瀉總苷對(duì)去勢(shì)雌性小鼠子宮重和左股骨重的影響（見(jiàn)表4）結(jié)果顯示模型對(duì)照組子宮系數(shù)和左股骨系數(shù)與假手術(shù)組間均有顯著性差異（均P<0.01）；己烯雌酚組和番瀉總苷高低劑量組子宮系數(shù)和左股骨系數(shù)與模型對(duì)照組之間均有顯著性差異（均P<0.01），表明番瀉總苷有雌性激素樣促進(jìn)子宮增生和使骨質(zhì)鈣化加重的作用。
2.5番瀉總苷對(duì)去勢(shì)雌性小鼠血鈣、血磷和降鈣素含量的影響（見(jiàn)表5）以血鈣為指標(biāo)，模型對(duì)照組與假手術(shù)組間差異有顯著性（P<0.01）；番瀉總苷高低劑量組與模型對(duì)照組間差異有顯著性（P<0.01）。表明番瀉總苷可以降低血鈣，使骨質(zhì)鈣化。以血磷為指標(biāo)，假手術(shù)組和給藥組與模型對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異。以降鈣素為指標(biāo)，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組小鼠血清降鈣素下降，番瀉總苷組與模型對(duì)照組比較血清降鈣素呈上升趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著差異。
3討論
本研究所用樣品番瀉葉的活性成分，主要為番瀉苷A和番瀉苷B，采用國(guó)際上通用的乙醇和水兩種溶劑提取制備。根據(jù)文獻(xiàn)[6]的工藝考查，發(fā)現(xiàn)65%濃度的乙醇對(duì)番瀉苷A、B提取效果最佳，故采用65%乙醇作為醇提取溶劑。
方法1中計(jì)數(shù)黑便時(shí)，應(yīng)隨時(shí)將小鼠排出的已計(jì)數(shù)的黑便清除，否則易混淆。方法2中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取成年體大的健康小鼠為好，腸管粗大易于操作。
在小鼠排便和腸道炭末推進(jìn)法實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)A-e、B-e、A-w、B-w各給藥組小鼠排泄的黑便不成形，成稀軟狀，而且與生理鹽水對(duì)照組相比兩種番瀉葉給藥組均具有明顯的增加排黑便數(shù)量，縮短首次排黑便時(shí)間和增大墨汁推進(jìn)率的作用（均P<0.01），因此推斷其作用機(jī)制可能與加強(qiáng)腸蠕動(dòng)有關(guān)。此外，無(wú)論A-e組與B-e組還是A-w組與B-w組在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明國(guó)產(chǎn)番瀉葉與進(jìn)口番瀉葉不僅外觀性狀鮮有差別而且有著基本相同的藥效學(xué)作用。
本研究采用大孔吸附樹(shù)脂法富集純化番瀉總苷，與單純的乙醇或水提取方法相比，番瀉苷純度較高，一般番瀉苷A、B之和可達(dá)20%以上。
骨質(zhì)疏松是中老年，尤其是老年女性的常見(jiàn)病、多發(fā)病，因此對(duì)此病的防治已成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的重要課題。本實(shí)驗(yàn)觀察到番瀉總苷能縮短去勢(shì)小鼠動(dòng)情周期，有雌性激素樣促進(jìn)子宮增生和使骨質(zhì)鈣化加重的作用，提示了該藥的雌性激素樣抗骨質(zhì)疏松作用。