血管形成測定范文
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血管形成是從已經(jīng)存在的血管床中通過內(nèi)皮細胞增殖和遷移,以芽生或非芽生的方式生成新生血管系統(tǒng)的過程，與正常的生理過程(如傷口愈合、胚胎發(fā)育等)和許多病理過程(如腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腦和心血管等疾病)密切相關(guān)[1,2]。血管形成中的主要細胞是內(nèi)皮細胞，它存在于所有的血管上，通過內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、分化和結(jié)構(gòu)重建構(gòu)成了新的毛細血管網(wǎng)。除內(nèi)皮細胞在血管發(fā)生過程起重要作用外，支持細胞(如腫瘤細胞、外周細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞)、細胞外基質(zhì)、血液細胞和體液成分也都與血管的發(fā)生有關(guān)。因此，血管發(fā)生的測定非常復(fù)雜。當(dāng)今尚未有任何一種體外的實驗方法能精確地模擬這一復(fù)雜的過程，但結(jié)合體外、體內(nèi)血管形成的測定方法，可以有效地了解血管發(fā)生的作用機理。
本文介紹了當(dāng)前體內(nèi)外用來研究血管形成的一些基本方法和最新方法，并對這些方法的優(yōu)缺點進行了深入探討。
1血管形成的體外測定方法
體外測定血管形成的方法主要側(cè)重于外源性抑制劑或刺激因子對內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和成管的作用。
對內(nèi)皮細胞的測定，關(guān)鍵問題在于內(nèi)皮細胞具有物種和器官的差異性。內(nèi)皮細胞表型的差異已在大血管衍生的內(nèi)皮細胞(如人臍靜脈內(nèi)皮細胞)和微血管器官的內(nèi)皮細胞(如人類皮膚毛細血管內(nèi)皮細胞)中被證實[3,4]。在培養(yǎng)中，內(nèi)皮細胞的活化狀態(tài)、染色體表型、細胞表面抗原的表達和它們的生長特性都會發(fā)生改變，將失去體內(nèi)生長的一些特性[3]。另外，在體外，內(nèi)皮細胞在靜止環(huán)境、動態(tài)環(huán)境、結(jié)合不同的基質(zhì)的情況下，它們的特征也不同，因此它并不能完全代表體內(nèi)復(fù)雜的生理過程。盡管用內(nèi)皮細胞作為模型來研究體內(nèi)血管發(fā)生具有很大的局限性，但體外測定方法具有快速、易定量、可重復(fù)性高等特點。
1.1內(nèi)皮細胞增殖測定法
血管內(nèi)皮細胞的增殖是血管發(fā)生的重要步驟。目前，已有多種成熟的細胞增殖測定方法，如四氮唑鹽還原法等。[3H]?殘叵汆奏げ羧敕ê拖赴?周期動力學(xué)檢測法是兩種主要的細胞增殖測定方法。
四氮唑鹽〔3??(4,5??dimethylthiazol??2??yl)??2,5??diphenyl??tetrazoliumbromide,MTT〕還原法，又稱MTT比色法，是一種最常用的檢測細胞存活和生長的方法。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶使外源性MTT還原為藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。MTT結(jié)晶形成量與細胞數(shù)成正比。該方法已被用于檢測活細胞增殖，并廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性實驗以及腫瘤放射敏感性測定等[5]。
與之相比，[3H]?殘叵汆奏げ羧敕ㄊ且恢指?好的測定細胞增殖的方法。將同位素氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷(3H??TdR)作為DNA合成的前體摻入到增殖細胞中,通過放射自顯影觀察細胞增殖情況。傳統(tǒng)的以5?蹭逋蜒蹌蜍?(BrdU)作為核苷酸取代胸腺嘧啶摻入到新生成細胞的DNA中，通過用單克隆抗體檢測與DNA結(jié)合的BrdU，反映細胞增殖狀態(tài)的方法，雖然較以上方法有所進步，但其仍或多或少的受外源性示蹤物的影響[6]。同時細胞增殖的變化可能是由細胞毒性而非測試藥物的影響作用，因此結(jié)合細胞增殖測定法和細胞凋亡檢測法的特點，可能會獲得更為精確的結(jié)果。
1.2內(nèi)皮細胞遷移測定法
目前，對血管內(nèi)皮細胞遷移的影響，已經(jīng)有很多有效的測定方法。其中以改良的BoydenChamber或Transwell法最常用[7]。這些方法均是通過觀測穿過一定孔徑(如8μm)硝酸纖維素薄膜的細胞數(shù)量,確定細胞遷移能力。近年來雖然又有新型Millicell??HA底膜培養(yǎng)皿式雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)出現(xiàn),但是它們的原理一樣,利用細胞穿過微孔濾膜來觀測一種細胞對另一種細胞遷移的影響。
劃痕損傷的方法在國外出現(xiàn)較早。用移液器滴頭或刀片在單層血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)皿上劃痕，為邊緣內(nèi)皮細胞遷移提供一裸露區(qū)域。經(jīng)過創(chuàng)傷后邊緣的單層內(nèi)皮細胞可遷移至創(chuàng)傷區(qū)域，并重新形成新的單層內(nèi)皮細胞層。在光鏡下計數(shù)從損傷邊緣遷移出的細胞數(shù)和遷移的相對距離，并計算出細胞的實際遷移距離。然而這種方法的定量具有任意性。
1.3成管測定法
血管形成中最典型的測定是對內(nèi)皮細胞形成三維結(jié)構(gòu)能力的測定。在體外給予適合的細胞外基質(zhì)成分，內(nèi)皮細胞能形成管狀結(jié)構(gòu)。在含有膠原和纖維蛋白凝塊的塑料培養(yǎng)皿中，內(nèi)皮細胞初期在水平面形成細胞條索結(jié)構(gòu)，經(jīng)過12h或更長時間培養(yǎng)，細胞條索開始向上發(fā)出分支，貫穿凝膠形成三維的管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[8]。在一系列的血管發(fā)生測定中，成管測定占有重要的位置[9,10]。內(nèi)皮細胞不僅能在二維空間形成毛細管，也能在三維空間對細胞行為進行定量分析，這更為接近體內(nèi)細胞生長的環(huán)境。定量分析包括在凝膠中從下到上對不同長度管進行拍照，測量每個管的長度(水平面上的寬度和垂直面的高度)和管的最大直徑等。
1.4器官培養(yǎng)測定法
器官培養(yǎng)方法極大地推進了對血管形成的測定。器官血管形成測定法包括鼠主動脈環(huán)、雞主動脈弓、豬頸動脈、胎兒鼠骨移植測定法等。這些測定法非常相似，其中鼠主動脈環(huán)測定應(yīng)用最為廣泛。在體外，通常把分離的器官片段、胎盤或部分器官放于含有待檢測物質(zhì)的基質(zhì)(如纖維)中培養(yǎng)，10～14d后，可檢測內(nèi)皮細胞生長形成血管，通過測量移植體的長度和形成微血管的數(shù)目來定量測定血管的發(fā)生[11]。然而，血管定量測定也非常困難，因為微血管的向外生長總是成簇在一起，因此它們所覆蓋的區(qū)域就很難測定。
2血管形成的體內(nèi)測定方法
以上敘述的一系列體外測定方法已被用來研究血管形成的不同方面，然而對不同來源內(nèi)皮細胞的分離和體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同來源的血管內(nèi)皮細胞對各種外界因素的反應(yīng)不同。體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞行為和形態(tài)受到多種實驗參數(shù)的影響：基質(zhì)的自然狀況、所用培養(yǎng)介質(zhì)及血清的類型、各種外界因素、收集細胞的方法以及傳代次數(shù)等。因此，近年來體內(nèi)實驗系統(tǒng)被廣泛地重視和應(yīng)用，并且得到迅速發(fā)展。在以往發(fā)表的很多文章中，大量的體內(nèi)測定法已經(jīng)被詳細的描述過，筆者結(jié)合最新的進展作進一步的詳述。
2.1背側(cè)皮膚/氣囊模型測定法
背側(cè)皮膚/氣囊模型是用來檢測藥物對由體內(nèi)癌細胞所觸發(fā)的新生血管生成反應(yīng)的影響[12]。用濾紙覆蓋微孔環(huán)兩側(cè)，形成一個腔系，用腫瘤細胞懸濁液填充這個腔系，然后將其植入到麻醉老鼠的經(jīng)皮下注射形成的皮下氣囊中。用檢測物質(zhì)處理后，將腔室除掉，然后將相同的多聚物環(huán)放置在與腔系直接接觸的位點。新生血管形成的反應(yīng)可通過計數(shù)新生血管的數(shù)目來檢測。這種檢測法相對來說操作比較簡單，然而操作仍需細心，以避免引起腔系表面血管的形成，因為微孔環(huán)本身能誘導(dǎo)新生血管的形成，從而掩蓋了由細胞所誘導(dǎo)的新生血管的形成。
2.2海綿聚合體植入和基質(zhì)膠塞測定法
在皮下植入包含細胞或血管發(fā)生刺激因子的聚合體基質(zhì)(以海綿或基質(zhì)膠塞的形式)已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于研究體內(nèi)血管的發(fā)生[13]。將被檢測物直接或制成片劑置于海綿中，通過一系列的方法，如組織學(xué)(組織浸潤)、形態(tài)學(xué)(血管密度)、生物化學(xué)(DNA、蛋白和血紅蛋白的含量)等方法檢測新生血管生成[14]。然而，海綿的大小、形狀和組分的不同對實驗結(jié)果都會有影響;此外，植入能引起非特異性的免役應(yīng)答，這些免役應(yīng)答可能自身會導(dǎo)致血管形成的發(fā)生。
基質(zhì)膠塞測定法被廣泛用于評價生長因子的促血管新生能力,如VEGF[15]。基質(zhì)膠是富含層連蛋白的細胞基質(zhì),可以誘導(dǎo)和保持多種細胞的分化。基質(zhì)膠在4℃時成液態(tài),與各種生長刺激因子混合后注射到小鼠腹部皮下組織,在小鼠正常體溫條件下很快形成固體凝膠,使生長刺激因子緩慢釋放。通過組織學(xué)檢測，圖像分析塞內(nèi)的血管面積(mm3)或通過檢測基質(zhì)膠中血紅蛋白的含量對血管生成進行定量分析。盡管基質(zhì)膠比較昂貴，但與人工海綿相比,基質(zhì)膠提供了血管發(fā)生更為自然的微環(huán)境。
2.3雞胚絨毛尿囊膜(chickchoriollantoicmembrane，CCM)和卵黃囊(yolksacmembrane，YSM)膜測定法
雞胚絨毛尿囊膜和卵黃囊膜測定法是研究血管形成最常用的體內(nèi)測定法[16]，在很多文章中都有比較詳細的描述[17-19]。目前這兩種模型的應(yīng)用已較成熟，并且廣泛用于研究血管生成和抗血管生成中[20]。CAM模型有側(cè)室開窗法和頂端氣室開窗法，開窗暴露出CAM，以明膠海綿、定性濾紙或甲基纖維素作為載體，將藥物植入到CAM上,2～3d后就會觀察到移植物周圍典型的放射狀排列的新生血管。YSM法是對CAM法的改進，將72h雞胚整體去掉蛋殼，移植到無菌平皿中，這樣在YSM發(fā)育過程中，可以持續(xù)觀察血管發(fā)生的過程，并且可在更大范圍和時間內(nèi)定量測定血管的發(fā)生。該方法克服了CAM法難以確定加樣部位的缺陷，使藥品加入部位一致，并可在同一部位多次給藥，觀察結(jié)果簡便可靠。另外，近20年來，雞胚尿囊膜移植瘤模型也被用于腫瘤血管形成機制的研究。這種模型可能是研究腫瘤誘導(dǎo)的血管發(fā)生最理想的模型，因為宿主的免疫系統(tǒng)還沒有完全成熟，腫瘤種植到尿囊膜上2d內(nèi)保持無血管的狀態(tài)，之后新生血管進入腫瘤，并且快速生長，形成豐富的血管網(wǎng)。
雞胚尿囊膜和卵黃囊膜法技術(shù)具有相對操作比較簡單、取材方便、無需特殊設(shè)備、經(jīng)濟、實驗周期短、適合于大規(guī)模篩選等優(yōu)點，又能定性或半定量的檢測腫瘤組織、細胞分泌成分及各種生物因子對血管的活性作用，是研究腫瘤生物學(xué)特性，特別是腫瘤誘導(dǎo)血管發(fā)生的良好模型。但CAM和YSM本身就是一個豐富的血管網(wǎng)絡(luò)，這樣就很難從已存在的血管中區(qū)分出新生的毛細血管[22]。另外，CAM很容易發(fā)生炎癥反應(yīng)，對氧壓的變化也非常敏感，所以開窗就成為實驗過程中一個非常重要環(huán)節(jié)。
2.4角膜血管形成測定法
該測定法被認(rèn)為是一種最好的定性檢測方法。角膜本身是一個無血管的部位，因此，經(jīng)過血管發(fā)生誘導(dǎo)因子刺激而在角膜中所觀察到的血管都是新生血管，這樣就可以避免其他模型中所存在的原有血管干擾的現(xiàn)象[23]。
角膜微囊模型多采用嚙齒動物如兔、鼠的角膜。將含有誘導(dǎo)血管形成藥物的片劑或多聚體植入角膜，使藥物緩慢釋放，觸發(fā)新生血管的生成。檢測物質(zhì)通常以緩慢釋放的多聚體或片劑的形式植入到角膜中。然而許多多聚體檢測物成分可能會刺激角膜，引起炎癥反應(yīng)，從而干擾了血管發(fā)生的定量測定[24,25]。目前以聚乙烯海綿為載體給藥的方法就避免或減少了這種影響。實驗中，可用計算機圖像分析聯(lián)合黑色墨汁灌注角膜來定量測定新血管發(fā)生的反應(yīng)。最近，熒光染料標(biāo)記的高分子量葡聚糖已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于角膜血管發(fā)生[24]。目前，出現(xiàn)了一種非侵襲性的記錄整個角膜血管發(fā)生過程的方法[23]，計算機圖像分析聯(lián)合計算機圖像數(shù)據(jù)采集的方法，通過像素計數(shù)來計算血管的面積。
角膜血管發(fā)生測定法的優(yōu)點是:角膜本身沒有已經(jīng)存在的血管背景的問題，同時，實驗對象比較普遍。但是與CAM法相比，它具有花費高、技術(shù)要求高、不適合進行大規(guī)模篩選等缺點。此外，實驗器官涉及到眼，因此研究也面對著倫理道德的問題。
2.5腫瘤模型
腫瘤模型是用來檢測藥物抗血管生成和抗腫瘤作用的最終模型,包括人腫瘤模型及動物腫瘤模型。小鼠Lewis肺癌和黑色素B16等高轉(zhuǎn)移模型是常用的動物腫瘤模型,人腫瘤模型最常用的是裸鼠異種移植瘤[25]。利用高轉(zhuǎn)移的裸鼠移植瘤還可同時觀察抗血管生成物質(zhì)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力。腫瘤生長超過一定的大小就需要形成新的血管來獲得氧氣、營養(yǎng)和排除代謝廢物,因此一些特殊組織學(xué)分析，如血管密度、血流、凝血作用、腫瘤細胞的凋亡或壞死等都可用來作為檢測物質(zhì)對新生血管形成影響作用的指標(biāo)。
與CAM模型相比，腫瘤模型更適合研究腫瘤血管的發(fā)生。待測藥物的吸收、分配狀態(tài)、藥效等在腫瘤模型上都能得到比較精確的結(jié)果。另外，腫瘤模型也可用來檢測新藥物是否具有抗新生血管形成或抗血管生長的作用。然而,實驗所用的腫瘤細胞，特別是經(jīng)皮下移植的腫瘤細胞與常位生長的腫瘤細胞的生長環(huán)境是不同的，這可能會影響實驗結(jié)果。此外，要檢測新血管的形成，最后需要處死實驗動物，并需要花費長時間來準(zhǔn)備組織分析，這就不可能進行實時非侵襲性的研究[26]。新晨
3結(jié)語
隨著目前一系列潛在的血管形成抑制劑在癌癥臨床第2、3階段的實驗成功,開發(fā)新的抗血管藥物已經(jīng)成為治療癌癥和其他一些疾病的趨勢,而在臨床前的研究中，必須找到更為有效、合適的方式來檢測癌癥抑制劑對癌細胞或血管的抑制效果。同時，對于一系列的體內(nèi)、體外測定法，必須認(rèn)識到它們的局限性，才能對結(jié)果作出相應(yīng)的精確的解釋。
體外測定法的實施是測定待測試物質(zhì)作用關(guān)鍵性的第一步，給我們提供了大量有用的信息。然而，體外與體內(nèi)環(huán)境之間存在著很大的差異，并不能完全反映體內(nèi)血管的發(fā)生。因此，要對一種物質(zhì)在血管形成過程中的作用有充分的理解和評價，必須使用一種以上的體外測定方法來研究待測物質(zhì)在血管發(fā)生中的作用，然后使用一種以上的體內(nèi)測定法來驗證在體外測定法中所觀察到的結(jié)果。
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