中藥能顯著減弱大鼠腎組織范文
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1、材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1實驗動物Wistar大鼠，雄性，體重（180～200）g，山東大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（魯）20030004。
1.1.2藥品與試劑化痰活血軟堅湯由海藻、丹參、大黃、黃芪、當歸組成。上藥水煎2次，大黃后入，濾取藥液合并，減壓濃縮（80℃）為0.4g/mL，低溫保存備用。使用前放至室溫并搖勻。親和純化兔抗人多克隆TGF-β1抗體：SantaCruzBiotechnology，Inc.產品；FITC-羊抗兔IgG、TGF-β1mRNA原位雜交試劑盒、MMP-9mRNA原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。鹽酸多柔比星，深圳萬樂藥業有限公司生產，批號：0103E1，使用時以生理鹽水稀釋成1mg/mL的溶液。
1.2實驗方法
1.2.1動物分組將40只Wistar大鼠隨機分為正常組10只、模型組15只、中藥組15只，自由飲水進食，1w后進行實驗。
1.2.2模型制備30只大鼠稱重，腹腔注射（0.2mL/100g體重）1.75%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉，從背部摘除左腎，縫合傷口。正常組行假手術，不摘除腎臟，余與上同。手術1w后，30只造模大鼠尾靜脈注射阿霉素5mg/kg，手術5w后注射阿霉素3mg/kg。正常組尾靜脈注射生理鹽水。
1.2.3給藥方法第1次注射阿霉素1w后，中藥組灌服中藥（1mL/100g體重），正常組和模型組給予等量蒸餾水。連續給藥12w。
1.2.4標本采集摘取右腎，迅速冠狀切開，分別以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蠟包埋。甲醛固定組織切片厚度4μm，多聚甲醛固定組織切片厚度6μm。
1.2.5指標觀察
1.2.5.1腎組織TGF-β1檢測采用免疫熒光細胞化學技術。兔抗人TGF-β1抗體1∶100稀釋，PBS代替一抗作為陰性對照。激光共聚焦顯微鏡觀察，并用LaserMicrscopeLSM510Version2.5SP2軟件處理，每張切片任選5個視野，計算其平均熒光強度，作為該樣本TGF-β1的相對表達量。
1.2.5.2腎組織TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA檢測采用原位雜交法。OLYMPUSBX41光學顯微鏡觀察，每張切片任選10個腎小球，OLYMPUSC-4000ZOOM數碼相機照相（光亮度設定一致），用Image-proplus4.5圖像分析軟件對結果進行半定量分析，每張切片隨機選取10個視野，測定10個視野的積分光密度，以均值作為該樣本MMP-9mRNA的相對表達量。
1.2.6統計學方法數據以均數±標準差（x±s）表示，數據統計以SPSS11.0統計分析軟件進行單因素方差分析。
2、結果
2.1各組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1及MMP-9mRNA的表達
結果見表1。
由表1可知，模型組大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1表達顯著高于正常組（P＜0.01），中藥組大鼠二者的表達顯著低于模型組（P＜0.01）。模型組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達比正常組顯著降低（P＜0.01），而中藥組大鼠腎組織MMP-9mRNA表達則比模型組顯著升高（P＜0.01）。
3、討論
TGF-β1是腎小球疾病進展的重要介導因子，在免疫介導及非免疫介導的腎臟損傷模型中，系膜細胞、內皮細胞及浸潤巨噬細胞均可合成TGF-β1。在慢性腎衰復雜的病理機制中，如腎小球的高灌注、高濾過，腎小管損傷和間質纖維化，蛋白尿促進腎小球間質纖維化等多個環節均有TGF-β1參與。TGF-β1促進系膜細胞產生部分ECM并抑制其降解，增加細胞對ECM的黏附，促進ECM在腎小球內積聚，并有調節多種細胞因子的作用，從而直接參與腎小球硬化過程。腎臟病理組織學研究表明，在已有病變的腎小球中TGF-β1主要通過至少3種途徑促進ECM的積聚：①促進ECM成分如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原和多種蛋白多糖的合成；②抑制ECM的降解，既抑制降解ECM成分的酶類如膠原酶系的合成，又促進纖溶酶原激活物抑制因子和金屬蛋白酶組織抑制因子等的表達；③促進整合素的表達，進一步促進ECM表達［1］。
MMP-9屬于基質金屬蛋白酶家族成員之一，又稱為Ⅳ型膠原酶，對ECM的合成和分解起著重要的作用，其功能是參與ECM（主要為Ⅳ型膠原）的降解。既往研究證實腎小球固有細胞可合成和分泌MMP-9，與MMP-2共同參與保持腎組織ECM的動態平衡［2］。MMP-9分泌減少或其抑制物TIMP-1分泌增加，均可成為ECM積聚的重要原因。
本研究結果表明，化痰活血軟堅中藥能顯著減弱模型大鼠腎組織TGF-β1mRNA、TGF-β1的高表達，提示化痰活血軟堅法抗腎小球硬化的效應與其抑制TGF-β1mRNA表達及TGF-β1的分泌，從而減少ECM的積聚有關。化痰活血軟堅中藥還具有促進MMP-9mRNA表達的作用，表明化痰活血軟堅法可能通過促進MMP-9mRNA表達而增加MMP-9的產生和分泌，參與ECM的降解，因而發揮防治腎小球硬化的作用。
