絲素在生物醫學中的作用范文
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1絲素蛋白基本性質的研究
蠶絲是由20%~30%的絲膠蛋白和70%~80%的絲素蛋白以及極少量的色素、碳水化合物等構成。其中,絲膠蛋白是一種高分子量的球蛋白,其分子結構的支鏈上親水基含量較高,鏈排列不緊密,故易溶于水、稀酸和稀堿,并能被蛋白酶等水解,還具有與明膠類似的凝膠、粘著等特性。絲素蛋白由分子量為5萬左右的小肽鏈和分子量為30萬左右的大肽鏈組成。其蛋白質的氨基酸組成以甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸為主,與人體的皮膚和頭發的角朊極為接近,這成為一些研究中,將絲素用于人造皮膚制造的原因之一。絲素蛋白的結晶部分為較為緊密的β-折疊結構,在水中僅發生膨脹而不能溶解,亦不溶于乙醇等有機溶劑,但可在一些特殊的中性鹽溶液中發生無限膨脹形成粘稠的液體,透析除鹽即可得到絲素的純溶液。然后通過噴絲、噴霧或延展、干燥等處理,可得到再生絲、凝膠、薄膜或微孔材料等產品。
對絲素蛋白的研究發現,與明膠、清蛋白等普通蛋白相比,其固化結晶方式具有多樣化的特點:既可沿用一般天然蛋白的傳統固化工藝,采用戊二醛做交聯劑;也可以通過一些獨特的處理方式來達到目的,如冷凍、熱蒸、拉伸及低毒性有機溶劑浸泡等[1]。特別是采用冷凍干燥,短時高溫與乙醇浸泡的協同處理方式,可以很好地保持天然蛋白的高度生物親和性,并適應藥物載體應用中,一些對高溫或某種固化劑敏感的負載藥物的特殊要求,在應用方面體現出更大的靈活性。在絲素蛋白的特性研究中,其良好的成膜性是最受人們關注的熱點之一[1]。與傳統應用較多的天然高分子材料———殼聚糖與膠原等相比,絲素蛋白膜成膜方便性更好,還可以保持高達98%以上的透明性,在高濕狀態下的柔韌性與形態保持性能也較為突出[1],有利于制造一些在臨床或實驗中要求透明性,以便觀測提取生物信息或體內高濕環境使用的生物醫學產品。另外,在成膜條件適當的情況下,絲素膜可以表現出優良的透氧透氣性能,如1mm厚的絲素膜,其透氧率每平方米可高達33mL/h[1],不亞于甚至超過目前一般認為在這方面性能卓越的合成材料,如聚-L-亮氨酸膜或聚羥乙基丙烯酸膜。但單純的絲素蛋白膜也存在一些缺陷。
因為純絲素膜的穩定性和強度主要取決于膜中的β結構和分子間氫鍵,但純絲素膜中這兩者含量并不多,使絲膜的結晶區相對較少,使其在某些應用中受到限制。例如純絲素膜在含水量極低時易于破碎,在低濕環境應用時強度不夠;結晶區偏少也會導致絲素膜在溶液中的溶失率較高。對此,目前除了篩選合適的固化工藝來提高膜的結晶區比例外,研究中的一個新熱點是希望通過復合材料性能互補的原理,來多方位的改善絲素膜的物理性能。目前用來與絲素構建復合材料的主要有:海藻酸鈉、殼聚糖、聚谷氨酸鈉、間規聚乙烯醇等[1-4]。其中,海藻酸鈉分子量為5萬~20萬,按適當比例與絲素復合后,在紅外光譜中可見膜中的β結構吸收峰增高,有效地增加了絲素膜的總結晶度。而且海藻酸鈉具有優良的吸水性,與絲素復合后,使復合膜在斷裂強度、熱穩定性與吸濕性方面均比純絲素膜得到了比較顯著的改善[2]。
2生物分析及藥物緩釋載體方面的應用
在固定化酶及免疫測定方面的應用研究已較為深入,取得了不少有應用價值的成果。如日本利用絲素固化特定的單克隆抗體,開發成功癌癥自動診斷儀,其敏感度達到7min內能測定1μg/L腫瘤標識體AFP濃度,受到廣泛注目[1,5]。基于絲素能將酶固定,又具有良好的基質透過性,能使酶保持足夠的自由度的原理,將治療苯丙酮尿癥的藥物苯丙氨酸酶負載在絲素上,可以在酶解效應與游離態酶相當的情況下,防止該酶與腸內的胰蛋白酶等作用失活,從而延長其在體內的半衰期3~4倍,起到比直接口服更好的治療效果。同樣根據此原理,日本研制出葡萄糖氧化酶絲素固定膜,作為測定葡萄糖濃度的生物傳感器的響應部件,獲得了非常令人滿意的測定結果,測定穩定性亦較好[6,7]。
特殊的多孔性網狀膜結構使絲素膜本身具有優良的吸附及緩釋功能,若經過丙烯酰接枝反應后其最大吸水率可達300倍左右[8],能大大提高凝膠態的水及乳化油的穩定性,從而抑制揮發性成分的蒸發,延緩經過皮膚吸收的藥物釋放速度,成為很好的藥物緩釋劑。另外,目前一些比較昂貴或全身性副作用比較大的藥物如抗癌藥物直接口服則效果低、成本高,因此將藥物負載在一些天然蛋白質如明膠、血清蛋白中,并添加磁粉制成磁微粒,然后通過磁控制從血液輸送到靶位,可以顯著地提高靶位藥物濃度,降低全身副作用,是一種極有應用價值的藥物治療方式。但明膠、血清蛋白往往有較明顯的抗原或在固定化時需要高溫,而這類藥物中有許多在高溫下都易降解,容易影響負載率。絲素抗原性不明顯[6],還可以選擇一些非高溫方式固化。因此,很有可能成為制造這種靶向藥物載體的一種新材料。總的來講,目前利用絲素負載藥物或酶時,一般采用2種方式:簡單包埋法與共價交聯法。
前者主要是被負載物與絲素溶液簡單混合后固化成產品,具有簡單方便,一般不采用過多化學試劑的特點,可以較好地保存絲素的天然性。但由于負載方式是吸附式,所以負載的牢固程度欠佳;而且對酶來講,由于被包在絲素蛋白內部,使大分子底物不容易透過,從而限制了使用性能。而共價交聯法是根據絲素蛋白分子中含有大量側鏈羥基和一定量的氨基的特點,采用包括戊二醛在內的多種化學試劑處理使被負載物與絲素間產生共價鍵,使之較為穩定地固定在絲素蛋白上。這種方式加工工藝比較復雜,對不同的被負載物來講往往不具備廣泛適用性。一些固定劑有可能影響絲素的生物親和性。但由于負載穩定,不容易引起所謂的暴釋現象,而且可以將酶固定在膜的表面。因此,在體外使用的生物分析中,顯然比簡單包埋法要好。但在體使用時,應該注意到一些高毒化學試劑對絲素親和性的破壞,在緩釋時間能夠保證的情況下,簡單包埋法仍然不失為一種快捷簡便的方法。
3人工器官及組織工程支撐體材料方面的應用
目前應用絲素制造人工器官的熱點主要集中在人造皮膚上,已有暫時性皮膚替代物應用于燒傷的臨床治療上[6,7,9],被認為比目前常用的豬皮或創可貼擁有更良好的應用性能:其透明性使觀察創面的情況較為容易;創面的痛感較弱,絲膜與創口貼合緊密,但又不易融化,可以防止感染,同時又保持良好的透氣性,再加上絲素本身對皮膚細胞的生長促進功能,使其愈創效果更顯突出。而且絲素膜在消毒、剪裁與保存方面也比豬皮方便[6]。在人工血管和角膜方面探索相對而言比較少,亦大多停留在短期替代物的研制或應用基礎研究上,離具有完整功能的組織構建還有相當距離。但從已有的一些研究(如隱型眼鏡的制造使用)至少顯示,絲素材料在這些器官中應用時生物親和性能良好,已經具備了進一步開發的潛力。另外,組織工程的一項重要內容是研究用于組織修復的生物替代物。其中,具有良好生物相容性、生物可降解吸收的支撐體材料的開發尤其受到國內外的廣泛重視[1,7,9]。
目前,具備上述功能的較有代表性的合成高分子材料有聚乳酸、聚酸酐和聚羥基乙酸等,天然高分子材料有殼聚糖、膠原纖維等。由于絲素蛋白與人體皮膜組織的氨基酸構成相近,生物相容性好,而且來源豐富,易于得到高純度的材料,成型加工方便,特別是可利用蠶絲生產中的大量副產物———下腳繭與廢絲作為原料,故成本較低。而且,根據國內外的研究[7,9]及我們目前的實驗結果表明,絲素蛋白的降解產物本身不僅對組織無毒副作用,還對如皮膚、牙周組織有營養與修復的能力,對肝臟功能的恢復亦頗有特色。另外,經過適當處理的絲素膜能承受在常規高溫滅菌消毒和細胞培養液的浸泡而形狀不會產生明顯變化,在吸水的情況下,α型絲素膜的多孔網狀凝膠結構能夠適應細胞的附著、鋪展,對增殖極為有利。因此,絲素有望成為有發展潛力的新型組織工程三維支撐體材料,用于制造真正意義上的永久性人工器官。
4急待解決的一些問題
4.1特殊器官中的生物親和性的研究
根據大量的研究顯示,絲素膜在皮膚、口腔及眼睛等部位的生物相容性良好,抗原性不明顯,皮下埋植試驗表明,無明顯炎癥或占位現象發生[6,7,9,10]。但要將絲素膜應用于與血液直接接觸的器官如人工血管的建造上,其血液相容性則必須加以詳細的研究。尤其是,血液相容性與膜的結晶結構及表面狀態密切相關,故絲素膜成膜條件或復合膜的復合物選擇,應不僅取決于對膜力學性能的考慮,還應綜合考慮其在特殊器官中的生物相容性。絲素的氨基酸排列是以—(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)—重疊結構為特征的,其中,Ser之間的距離,與肝磷脂中的抗血凝結構即硫酸基間的距離十分相近,因此在絲素中的Ser上引入硫酸基進行改性處理,就有可能增加其血液相容性。而且根據初步的研究,改性后的絲素在抗凝血性能方面得到了明顯的改善,雖然仍然比肝磷脂略低,但確實顯示出積極的結果[8]。對其抗凝血機理進一步的探索,有可能使絲素成為比較好的人工血管構建材料。
4.2在體藥物負載及降解特性的研究
在生物醫學高分子的研究中,最受關注的是生物可降解的高分子。在通常情況下,原始狀態下的絲素蛋白,除其中占總體極少部分的非結晶區對稀酸稀堿有一定程度的敏感性,可部分降解外,整體的酶降解性能極差,使得其生物降解性不好[11]。而經過我們研究表明,通過中性鹽溶解法使絲素蛋白分子量適當降低,暴露出部分可酶切部位,可以使絲素蛋白的體外酶解率大大提高,表現為可被胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等降解成為分子量幾十到幾百的小分子肽。而在動物實驗中,其消化吸收率可由原來的20%上升到50%以上。絲素蛋白在成膜以后的生物降解性能則不但取決于絲素的分子量,還與成膜條件有關。目前在用絲素蛋白負載藥物或酶時主要是利用普通包埋法,即絲素溶液與被負載的物質混合,然后干燥固化成膜的方式。為了提高被負載物穩定性,往往在后期處理時還采用乙醇等有機溶劑來提高絲素蛋白的交聯程度。在成膜過程中固化溫度與時間,以及后期固化劑的選擇,對絲素膜中結晶區所占的比例,以及結晶區中難以酶解的β化構象的比例,起著至關緊要的作用[11]。
由于這兩個比例對絲素膜的機械性能甚至對藥物的緩釋速度都有極為重要的影響。因此,要根據具體情況來控制不同應用方向的絲素膜的成膜條件,以便在生物降解速度與膜機械性能的維持或藥物緩釋速度之間尋求一個比較好的平衡點。但目前,對于絲素膜的降解主要是研究考察了其分子結構與膜結構與孤立于生物體外,在酸堿酶作用下的降解,少量亦涉及到其分子結構與消化吸收的關系,對其在體內非消化器官中的體液接觸下的降解及藥物負載與緩釋機制則尚不清楚,從而影響了其在人工血管,非口服的藥物載體等方面的開發應用。
而且對于生物降解高分子,最重要的指標是生物降解速度的控制,對于應用于生物體內的材料來說,這不僅取決于與之接觸體液的化學構成,也與溫度、力學環境等生物物理因素有關。由于導致絲素蛋白降解的主導因素是酶,而據研究表明,蛋白的構象在流場剪切力的作用下可發生變化,從而影響底物與催化劑的結合,使反應速度受到影響[12]。因而在心血管系統的器官中,復雜的體液流場因素對材料降解的影響尤為重大[13-15]。為此,筆者已著手在綜合運用生物化學與生物流變學的觀點,通過設計體液流場、溫度等物理環境模擬系統,對血管與骨膜兩類絲素膜較有潛力發展人工替代物的器官環境下,膜結構、體液成分、體液溫度、體液流場變化等因素與絲素蛋白降解的關系進行研究,以期全方位的深入了解絲素在體降解的機制,為拓展絲素在生物醫學領域中的應用提供進一步的理論基礎。