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1材料與方法
1.1實驗器械
鈦片（寶雞科迪普有色金屬加工有限公司），掃描電鏡（S-3400N,日本日立公司），倒置顯微鏡（XD-101型，南京江南電股份有限公司；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），離心機（TDL-40型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；酶標(biāo)光度儀（Bio-TekE1312E,USA），細(xì)胞計數(shù)板（浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠）。
1.2實驗材料
α-MEM培養(yǎng)基（?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司），胎牛血請（杭州四季青公司），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶（美國Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，捷瑞生物工程有限公司），MTT試劑盒（凱基生物科技發(fā)展有限公司，KeyGen），ALP檢測試劑盒（南京建成公司），波形絲蛋白抗體、角蛋白抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士得公司）。
1.3實驗步驟
1.3.1鈦片的處理
光滑組與粗化組鈦片由西安寶雞科迪普有色金屬加工有限公司制備提供。具體方法如下：用直徑10mm純鈦棒線切割加工成厚1mm的圓鈦片，以金相砂逐級打磨至1200目，直至表面平滑、呈現(xiàn)灰白的金屬色為止，然后用丙酮、75％乙醇和去離子水在超聲清洗器（KQ250）輪流清洗15min,以除去材料表面機械加工而殘留的油污，40℃烤箱烘干，即得到光滑組鈦片。再以40目金剛砂噴光滑鈦片的表面，每試樣30片﹙樣本表面呈均一灰色﹚，進(jìn)行上述同樣的超聲清洗后，40℃烤箱烘干，得到粗化組鈦片。鈦片的分組：鈦片經(jīng)以上處理后分為4組：光滑組、粗化組、酸蝕組（同粗化組處理后用5.8mol/LHCl和8.96mol/LH2SO4混合液處理10min，雙蒸水沖洗，50％干燥）及雙氧水組（同酸蝕組處理后，8.8mol/LH2O280℃處理30min,400℃熱處理1h）。
1.3.2人牙周膜細(xì)胞﹙HumanPeriodontalCellshPDL﹚的原代培養(yǎng)及傳代
（1）組織來源：正畸需拔除的11～17歲青少年的雙尖牙（A、B、C、D四區(qū)均可），無炎癥、無齲壞的正常牙齒（貴陽醫(yī)學(xué)院附院頜面外科提供）；（2）細(xì)胞培養(yǎng)：取11～17歲青少年正畸需拔除的雙尖牙用生理鹽水沖洗3遍，放入加有10％雙抗的DMEM培養(yǎng)基中立即帶回實驗室，在超凈工作臺上用加入10％雙抗和10％甲硝唑的D-Hanks液沖洗3遍。然后將牙齒放入含0.1％Ⅰ型膠原酶（2ml）的青霉素小瓶中，在37℃孵育箱中消化1h并且每10min震蕩1次。終止消化后用吸管吹打牙齒根面，離心8min（1000r/min），加入含10％血清和1％雙抗的高糖的a-MEM培養(yǎng)基，移入培養(yǎng)瓶中并將培養(yǎng)瓶放入37℃CO2孵育箱中培養(yǎng)，鏡下見細(xì)胞貼壁后隔日換液；（3）hPDL的傳代：待細(xì)胞長至瓶底80％后，用25%的胰蛋白酶以1∶2消化傳代。
1.3.3hPDL的鑒定
取生長良好的第4代細(xì)胞做細(xì)胞爬片，1周后采用ABC法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色鑒定人牙周膜細(xì)胞。正常的hPDL來源于中胚層，抗波形絲蛋白陽性，而抗角蛋白染色陰性。
1.3.4hPDL的HE染色
取生長良好的第4代細(xì)胞做細(xì)胞爬片，1周后將爬片取出，丙酮固定后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察并拍照。
1.3.5hPDL的接種
將處理好的鈦片置于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，取生長良好的第4代牙周膜細(xì)胞，0.25％的胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度至10×104/ml,取0.1ml該細(xì)胞懸液涂布于鈦片表面，6h后每孔加入1mlH-DMEM培養(yǎng)基，放入37℃CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
1.3.6MTT法檢測材料的細(xì)胞毒性
取生長良好的第4代細(xì)胞，將其按1×104個接種到24孔板中，每孔培養(yǎng)液0.2ml，分為4組，每組20個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后第2天每孔加入MTT溶液0.5ml，離心后在37℃CO2孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去上清培養(yǎng)液，每孔加入1ml二甲基亞砜（DMSO），在搖床上震蕩15min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇波長550nm，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，每組20個樣本求均值。
1.3.7鈦片表面hPDL數(shù)的測定
分別于接種后每天取出鈦片各20塊D-Hanks沖洗3遍，置入另一塊潔凈的24孔培養(yǎng)板內(nèi)，胰蛋白酶消化2min，吸出胰蛋白酶，加入含血清的DMEM，每孔0.5ml。用吸管吹打鈦片表面，用血球記數(shù)板計數(shù)，將計算結(jié)果換算為每毫升懸液所含細(xì)胞數(shù)，每組重復(fù)計數(shù)4次。每天計數(shù)1次，共計數(shù)8d。
1.3.8hPDL的ALP活性檢測
取生長良好的第4代細(xì)胞接種（分為4組，每組20塊鈦片），每孔加入礦化液（1×10-2mol/LB甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C、1×10-7mol/L地塞米松）培養(yǎng)2d，每孔加入0.1ml0.1％tritonX-100,4℃過夜。加入底物37℃培養(yǎng)30min，用0.1％NaOH終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測OD值，波長520nm。每組20個樣本求均值。測6d，以礦化時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制人牙周膜成纖維細(xì)胞的ALP活性圖。
1.3.9掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM）觀察4種鈦片表面形態(tài)
取已經(jīng)處理完畢的鈦片各1片（共4片）置于掃描電子顯微鏡下觀察其表面形態(tài)。實驗條件：加速電壓30kV，電流5×10-10，工作距離15mm。
1.3.10掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope,SEM）觀察人牙周膜細(xì)胞在4種鈦片上的生長形態(tài)
將生長良好的第4代細(xì)胞接種在鈦片上培養(yǎng)3d，PBS沖洗3遍，戊二醛固定30min，自然干燥后噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。實驗條件：加速電壓30kV，電流5×10-10，工作距離15mm。
1.4統(tǒng)計分析
實驗結(jié)果選用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，P<0.05時差別有統(tǒng)計學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1人牙周膜細(xì)胞的形態(tài)細(xì)胞呈梭形、多角形或星形，胞突細(xì)長，胞漿豐滿，細(xì)胞核1～2個，呈圓形或橢圓形。細(xì)胞密度較低時交織成網(wǎng)狀，細(xì)胞密度較高時排列成束狀或旋渦狀。見圖1和圖2。
2.2人牙周膜細(xì)胞的鑒定免疫組織化學(xué)實驗顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，胞漿為棕黃色；角蛋白染色陰性，蘇木精復(fù)染后胞核呈紫色證明為中胚層組織來源。
2.3掃描電鏡下鈦片的表面形態(tài)
掃描電鏡照片清楚的顯示了四組鈦片樣本的表面形態(tài)差異（見圖5～8）。光滑組鈦片表面在電鏡下顯示出由于砂紙打磨造成的規(guī)則的環(huán)狀打磨線條，但是表面基本光滑，無明顯的凸起和凹陷；粗化鈦片表面非常粗糙，有非常不規(guī)則的不同形態(tài)的凹陷和尖銳的凸起；酸處理鈦片表面微孔較粗化組小且均勻；雙氧水處理鈦片表面出現(xiàn)多級孔洞的結(jié)構(gòu)，并且表面的凸起和凹陷也較粗化鈦片及酸處理鈦片更為柔和，還可以看到表面有一些比較均勻的結(jié)節(jié)狀沉積層，鈦表面被完全覆蓋。
2.4細(xì)胞接種在4組鈦片上的掃描電鏡觀察細(xì)胞在4組鈦片上都能生長而且形態(tài)相似，都呈不規(guī)則的梭形。見圖9～12。
2.5MTT法檢測材料的細(xì)胞毒性取3份樣本讀取的平均值作為最后的實驗結(jié)果。計算細(xì)胞相對增殖率RCR％=實驗組OD值/空白對照組OD值。用5級毒性分級法評定材料的細(xì)胞毒性［4］。見表1。表1人牙周膜細(xì)胞的相對增殖率及材料毒性評級（略）
2.6細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞計數(shù)為縱坐標(biāo)繪制的細(xì)胞計數(shù)圖。見圖13。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析：第1天4組細(xì)胞的計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義﹙P＞0.05﹚，從第2天到第8天差異有統(tǒng)計學(xué)意義﹙P＜0.05﹚。
2.7hPDL的ALP活性檢測以礦化時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制hPDL的ALP圖。從圖14可以看出，加入礦化液后第1天4組鈦片上hPDL都表現(xiàn)出了ALP活性，但是差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在第2、3、4天4組的ALP活性處于波動期。到第5、6天ALP活性趨于穩(wěn)定而且4組細(xì)胞的ALP活性差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中雙氧水組細(xì)胞的ALP活性最高（P＜0.05）。
3討論
3.1hPDL相對增殖率及材料毒性評級實驗結(jié)果顯示，光滑組細(xì)胞增殖率為80.94％，材料毒性評級1級，粗糙組細(xì)胞增殖率為114％，材料毒性評級0級；酸蝕組的細(xì)胞增殖率為123％，材料毒性評級為0級；雙氧水組細(xì)胞增殖率為140％，材料毒性評級0級。說明這4組鈦片表面毒性評級為無毒、低毒，都可以作為人體口腔種植材料。
細(xì)胞在4組鈦片上的增殖曲線顯示，細(xì)胞從第2天開始分裂增殖活躍，呈對數(shù)生長，到第7天細(xì)胞達(dá)到飽和密度時，細(xì)胞生長處于停滯狀態(tài)。細(xì)胞生長曲線呈滯緩-對數(shù)生長-平臺模式。統(tǒng)計結(jié)果顯示，4組細(xì)胞的生長及增殖有差異，而且雙氧水組細(xì)胞的生長及增殖最快（P＜0.01）。
3.2鈦片的表面形態(tài)對hPDL的影響
國外有學(xué)者通過研究光滑表面與粗糙表面人牙周膜細(xì)胞移行、黏附及排列的影響，得出粗糙表面有利于細(xì)胞的移行、黏附及排列［5］。在本實驗中，光滑組鈦片表面hPDL的相對增殖率為80.83％～81.06％，粗化組鈦片表面hPDL的相對增殖率為114％～115％，酸蝕組鈦片表面hPDL的相對增殖率為123％～124％，雙氧水鈦片表面hPDL的相對增殖率為140％～141％。粗化組、酸蝕組、雙氧水組都形成了不同程度的粗糙面，因此，這3組鈦片表面細(xì)胞的生長與增殖都明顯高于光滑組。而在這3組中，雙氧水組細(xì)胞的生長及增殖最快（P＜0.05），這個結(jié)果可能與雙氧水處理后鈦片表面能形成多級孔洞的結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙氧水處理鈦片表面是一種新的化學(xué)蝕刻方法，2005年何福明［6］等研究發(fā)現(xiàn)。雙氧水法處理鈦片后掃描電鏡觀察可以得到粗糙的表面，并形成明顯的多級孔洞結(jié)構(gòu)。
3.3細(xì)胞在4種鈦片表面的ALP活性ALP活性是牙齒和骨等硬組織形成、代謝、再生過程中的重要礦化酶，同時ALP又是細(xì)胞分化成熟和成骨能力的重要標(biāo)志酶，是前體細(xì)胞向骨化亞群細(xì)胞分化和向骨組織轉(zhuǎn)化的前提［7］。hPDL有向成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，ALP活性的變化可以顯示其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力［8］。從人牙周膜細(xì)胞ALP活性圖可以看到，在加入礦化液以后，人牙周膜細(xì)胞在4種經(jīng)不同方法處理的鈦片表面都表現(xiàn)出了ALP活性，并且都是達(dá)到峰值后下降并保持在一個相對穩(wěn)定的水平，該結(jié)果可以說明礦化液對牙周膜細(xì)胞有成骨誘導(dǎo)作用。牙周膜細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可以參與礦化。其他學(xué)者的研究也證明，hPDL有向成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的趨勢，ALP活性的變化可以給予hPDL一定的誘導(dǎo)條件后，細(xì)胞表現(xiàn)出成骨傾向，即約在20d左右可以觀察到礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)，同時可以檢測到骨延蛋白和骨橋素在細(xì)胞礦化過程中的表達(dá)，而且hPDL的ALP活性是牙齦成纖維細(xì)胞的1.6～13.3倍［9～12］。本實驗的結(jié)果是在達(dá)到峰值后雙氧水組細(xì)胞的ALP活性保持在最高水平（P＜0.05），這可能與雙氧水處理后鈦片表面能誘導(dǎo)形成羥基磷灰石有關(guān)。因為傳統(tǒng)的粗化法和酸蝕法所形成的鈦片表面為無定形的TiO2層，無體外誘導(dǎo)磷灰石形成的能力。研究發(fā)現(xiàn)，雙氧水處理可以在鈦金屬表面獲得一層富含Ti-OH基團的非晶態(tài)TiO2層［13］。經(jīng)過400℃熱處理后非晶態(tài)的TiO2結(jié)晶轉(zhuǎn)變?yōu)殇J鈦礦晶相結(jié)構(gòu)。2004年，Rohanizadeh等［14］的研究證實了銳鈦礦晶相結(jié)構(gòu)表面更易誘導(dǎo)羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）結(jié)晶。經(jīng)H2O2預(yù)處理組表面HA與鈦基體結(jié)合強度更高。