綠色熒光標記檢測范文

本站小編為你精心準備了綠色熒光標記檢測參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

1材料和方法

1.1材料

臺式低溫高速離心機、臺式冷凍離心機和PA800毛細管電泳儀（BeckmanCoulter公司）；MiniVE垂直電泳系統（GEHealthcare公司）；原核表達質粒pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP（分別由廣東省蛋白質組學重點實驗室郭愛華和陳騰祥構建）；大腸桿菌菌株DH5α（本室保存）；質粒純化試劑盒（U-Gene公司）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）由Calbiochem公司生產；microconYM-10超濾濃縮裝置（Millipore公司）；TALONMetalAffinityResin（BDBioscienceClontech公司）；透析袋（Merck公司）；人單核細胞系THP-1（香港大學醫學院徐愛民教授惠贈）；無內毒素的RPMI-1640培養液和胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）由Hyclone公司生產；proteaseinhibitorcocktail（sigma公司）。

1.2方法

1.2.1質粒pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表達

用pET14b/MCS-EGFP及pET14b/EGFP-hCRP分別轉化BL21（DE3）大腸桿菌菌株，各挑取3個克隆到5mlLB培養液（Amp+）中，37℃振蕩擴增，當菌液OD值約為0.4時，加入5μl100mmol/LIPTG到5ml的菌液中，室溫振蕩4h，取1ml菌液3000r/min離心5min，加入200μl1倍SDS上樣緩沖液重懸沉淀，進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色觀察蛋白表達情況。各取表達目的蛋白的克隆1ml加入到200mlLB培養液（Amp+）中，按上述表達條件進行大量誘導表達。

1.2.2His-EGFP蛋白的純化

按TALONMetalAffinityResin試劑盒說明書，配制結合緩沖液、洗滌緩沖液和洗脫緩沖液。200ml轉化了質粒pET14b/MCS-EGFP的大腸桿菌經室溫誘導4h后，4℃8000r/min離心菌液10min，用4ml冰冷的結合緩沖液重懸細菌沉淀，超聲波裂解，4℃12000r/min離心20min，取上清加入到裝有TALONMetalAffinityResin的純化柱中，按操作說明進行親和色譜純化。洗脫得到的純化蛋白用Bradford方法定量。

1.2.3His-EGFP-CRP蛋白的純化

配制緩沖液A（50mmol/LTris-HCl、0.5mmol/LEDTA、50mmol/LNaCl、5％甘油、0.5mmol/LDTT，pH7.9）。200ml轉化了質粒pET14b/MCS-EGFP-CRP的大腸桿菌經室溫誘導4h后，4℃8000r/min離心菌液10min，用10ml含5％TritonX-100緩沖液A重懸沉淀，超聲波裂解細菌，4℃12000r/min離心20min。沉淀（主要為包涵體和細菌碎片）轉入5ml的玻璃勻漿器內，加入10ml含5％TritonX-100的緩沖液A充分勻漿沉淀，室溫靜置20min，勻漿液離心后取沉淀重復勻漿洗滌1次。加入10ml含3％十二烷基肌氨酸鈉（SKL）和0.3％十二烷基硫酸鈉（SDS）的bufferA，充分重懸沉淀，靜置60min以緩慢溶解包涵體。溶解產物4℃12000r/min離心20min，取上清加入到microconYM-10中，超濾濃縮到原體積的1/2。然后加入到TALONMetalAffinityResin的純化柱中，進行親和色譜純化。洗脫得到的純化蛋白用Bradford方法定量。

1.2.4SDS-PAGE檢測質粒原核表達和蛋白純化情況

分別取少量未轉化質粒的BL21（DE3）、誘導表達的轉化子、轉化子菌液裂解后的離心沉淀物及上清、親和純化的洗脫液，加入SDS上樣緩沖液，進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色觀察蛋白表達和純化情況。

1.2.5蛋白質重折疊復性及緩沖液置換

上述親和純化得到的His-EGFP和His-EGFP-CRP蛋白液分別加入到截留分子量為10kD透析袋中，放入到500ml含0.5mmol/LDTT的BufferA中，4℃透析12h，每3h更換透析液；將透析袋放入另一個500ml的透析體系（含1mmol/LGSH、0.2mmol/LGSSG和0.6mmol/LL-精氨酸的PBS）中，4℃透析12h，每3h更換透析液；最后放入500mlPBS溶液中，4℃透析3h，重復4次。用0.22μm的濾膜過濾除菌，Bradford方法定量，分裝后貯存于-80℃。

1.2.6熒光蛋白的高效毛細管電泳檢測

分別取純化后的His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白樣品，用PBS將濃度稀釋為100mmol/L，按操作說明加入到毛細管電泳儀PA800的專用樣品管內以備進樣檢測；檢測器選用激光誘導熒光（laserinducedfluorescence,LIF）模組，檢測波長為488nm；毛細管柱為N-CHO內涂層的石英毛細管，內徑50μm，總長度為50.2cm，從進樣端至檢測窗口的長度為40cm；采用真空抽吸進樣，壓力為2psi，進樣時間10s，電泳電壓為20kV，進樣端設置為正極，檢測端為負極。分別使用pH值為7.0、6.0、5.0、4.0、3.0的電泳緩沖液（0.1%Tween20，100mmol/L四硼酸納）對上述2種樣品進行分離檢測。

1.2.7細胞培養及His-EGFP-CRP結合活性檢測

THP-1用含10%FBS的RPMI-1640在CO2培養箱（37℃，5％CO2）中培養。細胞培養至1×1010個/L時，取5ml細胞培養物于25℃1000r/min離心5min，棄上清，用細胞裂解液（10%甘油、50mmol/LHepes-KOH、100mmol/LKCl、0.1%NP-40、2mmol/LDTT、10mmol/LNaF、0.25mmol/LNaOVO3、50mmol/Lβ-甘油磷酸）1ml、10μlproteaseinhibitorcocktail重懸沉淀，4℃靜置1h后，4℃14000r/min離心20min。離心上清中分別加入His-EGFP和His-EGFP-CRP的蛋白樣品（終濃度為100mmol/L），混勻后于37℃靜置30min，加入的樣品管中，按上述參數進行高效毛細管電泳檢測。

2結果

2.1pET14b/MCS-EGFP和pET14b/EGFP-hCRP的原核表達及其蛋白純化

如圖1A所示，與未轉化質粒的BL21（DE3）相比較，轉化了pET14b/MCS-EGFP的感受態細菌經IPTG于室溫誘導后，在約30kD分子量處出現了一條特異性條帶，與His-EGFP的理論分子量（約29kD）接近，表明誘導表達成功；菌液經超聲裂解后，離心得到的沉淀和上清中均檢測到高豐度的His-EGFP蛋白，說明His-EGFP的可溶性很好，但由于表達量很高，部分蛋白也可能在形成的包涵體內。經過金屬Ni離子親和色譜法純化后，結果顯示獲得的目的蛋白純度和回收率均很高。

如圖1B所示，pET14b/EGFP-hCRP轉染感受態BL21（DE3）并誘導后，在約50kD處出現1條表達量不是很高的特異性條帶，與His-EGFP-CRP的理論分子量值接近，說明誘導表達成功；菌液經超聲裂解后，沉淀中可檢測到大量的His-EGFP-CRP蛋白，而上清中幾乎檢測不到相應的條帶，提示原核中表達的His-EGFP-CRP溶解性很差，基本以包涵體的形式存在。包涵體經過洗滌、溶解后釋放出His-EGFP-CRP，經親和色譜法純化，得到純度較高的目的蛋白，回收率低于His-EGFP的純化。

2.2His-EGFP和His-EGFP-CRP樣品HPCE檢測

如圖2A和2B，當電泳緩沖液pH為7和6時，His-EGFP和His-EGFP-CRP的分離檢測效果很差，幾乎沒有熒光信號被檢測到；當pH值小于或等于5時，可以檢測到波長為488nm的綠色熒光信號，隨電泳緩沖液pH逐漸減小，信號峰的峰寬也逐漸減小，峰高增加。His-EGFP的檢測為單峰，提示His-EGFP的結構形式較為單一；而對于His-EGFP-CRP，pH值為5時，可檢測到2個峰，分辨率較低；pH值為4和3時，可檢測到3個峰，說明該蛋白的結構形式有多樣性。

2.3His-EGFP-CRP結合活性檢測

對加入了His-EGFP的細胞裂解物進行HPCE，除了在5～9min處有一些微小峰外，其分離圖譜與單純的His-EGFP樣品檢測沒有明顯差異（見圖2A和圖2C）。相對于單純His-EGFP-CRP樣品檢測，加入了His-EGFP-CRP的THP-1裂解物的分離圖譜出現了明顯的改變，3～7min處峰群的峰高和峰面積明顯減少，在8～13min處出現了新的峰群，以電泳液pH為4時最為明顯（見圖2B和2D），提示His-EGFP-CRP與某些細胞分子結合成為復合物，從而使其延遲時間發生了改變。

3討論

通過基因重組進行質粒構建、原核誘導表達、蛋白純化和復性的探索，擬為深入研究CRP內化入胞機制和胞內功能提供研究工具。在表達純化的探索中，發現原核表達的人CRP重組蛋白的溶解性很低，基本上以包涵體形式存在，利用高濃度的尿素和鹽酸胍等變性劑溶解包涵體的效果不佳，通過多次摸索，利用SKL、TritonX-100、SDS等去污劑和二硫鍵還原劑DTT增加了溶解包涵體和重組蛋白的能力，用金屬離子親和色譜方法獲得較純目的蛋白，在氧化還原體系GSH/GSSG和L-精氨酸條件下，通過緩慢降低去污劑的梯度透析方法對純化的蛋白質進行復性處理。

蛋白質復性后，利用HPCE技術對重組蛋白的一般理化性質和結合活性進行檢測。分離模式采用區帶毛細管電泳（capillaryzoneelectrophoresis,CZE），同時電泳液中加入少量（低于膠束濃度）的非離子型去污劑（Tween20）以減少蛋白質在管壁上的粘附。在這種分離模式下，帶正電荷的蛋白質由正極向負極遷移，并在負極端用LIF模組檢測，帶綠色熒光的蛋白質通過時可被檢測。結果發現，當電泳液pH≤5時，方可檢測到His-EGFP-CRP的熒光信號，因此提示融合蛋白His-EGFP-CRP的等電點（pI）接近于6，該蛋白質在低于其pI的溶液中帶正電荷，易于在該電泳模式下分離檢測。His-EGFP的檢測結果與His-EGFP-CRP相近，表明2種重組蛋白pI接近。

與His-EGFP的單峰相比較，His-EGFP-CRP的檢測出現多個峰，可能原因是復性后His-EGFP-CRP以多種結構形式存在。CRP閱讀框由2個外顯子和1個內含子組成，編碼含187個氨基酸的單體蛋白［1］。在血漿、組織液和細胞內，CRP的結構形式具有多樣性：有分子量為21kD的單體形式，也有由5個相同的單體（亞基）以非共價交聯的方式聚合成五角型盤狀結構，還有研究發現單體可以聚合成為纖維狀的結構［6］。這些結構的多樣性在一定程度上可以解釋CRP功能的多樣性。本工作構建的融合蛋白是在CRP的3’端掛上EGFP和his標簽，要使其能應用于CRP功能和內化機制的研究，其前提條件之一是增加的EGFP和his氨基酸序列不能影響CRP的結合活性。HPCE的結果顯示復性后的His-EGFP-CRP可能存在單體和多聚體的結構形式，提示CRP的聚合特性沒有受到His-EGFP影響。至于His-EGFP-CRP的多聚體結構形式，還需深入研究。

已有研究表明CRP能夠與小核核糖體蛋白、組蛋白、層粘連蛋白、磷酸膽堿和磷酸乙醇胺等細胞內或細胞膜上的分子物質結合［1，7］。為了解His-EGFP-CRP是否具有CRP的結合活性，將His-EGFP-CRP與單核細胞THP-1的裂解物進行孵育結合，HPCE結果發現His-EGFP-CRP的檢測峰增多了，提示His-EGFP-CRP與細胞裂解物中的一些分子結合形成了復合物；而單獨的His-EGFP仍然為單峰，并沒有形成復合物，說明His-EGFP-CRP結合活性是由其中的CRP部分所產生的，His-EGFP不影響其結合活性。本研究表明表達純化及復性的CRP融合蛋白雖然在3’端增加了His-EGFP序列，但是仍然保留CRP的結合活性，可以用于CRP胞內功能和內化機制的研究。