間充質干細胞定向范文
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1材料和方法
1.1材料
SD大鼠（清潔級，四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供，雌性，約150g）；胎牛血清（FCS，Gibco公司），胰蛋白酶（Gibco公司），血管內皮細胞生長因子（VEGF，invitrogen公司），堿性成纖維生長因子（bFGF,R&D公司）；FITC標記CD44、CD90、CD31、CD45抗大鼠單抗，Ⅷ因子山羊抗大鼠單抗（SantaCruz公司），即用型SP免疫組織化學檢測試劑盒（SP-9003，北京中杉金橋生物公司）。
1.2大鼠MSCs的培養
本研究采用梯度離心法加貼壁篩選法。取SD大鼠，頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離股、脛骨，暴露骨髓腔。用低糖無血清DMEM培養液沖出骨髓，離心后棄上清液，以無菌PBS液稀釋。取離心管，分別加入等量Percoll分離液（ρ=1.073kg/L）和骨髓稀釋液，離心30min（3000r/min）,仔細吸取白色單核細胞層，洗滌后用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養基（pH=7.2～7.4）重懸，并調整細胞濃度至4×105/ml，接種于250ml培養瓶，放入37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱靜置培養。7d后全量換液，后每3d換液1次。至14～16d時，將融合生長約80%的細胞以0.25%胰酶-0.04%EDTA消化，按1∶3傳代，定期取生長狀態細胞進行倒置相差顯微鏡觀察。
1.3大鼠MSCs表面抗原檢測
取生長已達到90％以上融合的P3代細胞，用0.25%胰酶-0.04%EDTA消化后，離心去上清液，無菌PBS液洗滌，4℃下4%多聚甲醛固定15min后，再用PBS沖洗。分別加入1∶100稀釋FITC標記的CD44、CD90、CD31、CD45單抗，于37℃下避光孵育30min，DAPI復染細胞核，90%丙三醇封片，使用激光共聚焦顯微鏡觀察。
1.4試驗分組及誘導分化
將P3代大鼠MSCs消化后按2.5×105/ml密度分為兩組，即誘導組及對照組。誘導組換入含10%FCS、10μg/LVEGF、4μg/LbFGF的低糖DMEM培養基進行內皮方向誘導分化；對照組換入新的含10%FCS低糖DMEM培養基。兩組均放入37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱靜置培養，每2d換液1次。
1.5內皮細胞特性的鑒定
兩組均繼續培養14d后，取出細胞，相差顯微鏡觀察細胞形態變化，使用倒置熒光顯微鏡進行CD31免疫熒光檢測，并計算其CD31陽性表達率。
2結果
2.1大鼠MSCs細胞形態學及表面抗原檢測
原代培養MSCs3d后可見細胞貼壁，5d后出現細胞集落，細胞大小均一，呈長梭形或多角型；10d后細胞基本達到90%以上融合，緊密排列成柵欄狀，柵欄中心呈多層分布。MSCs細胞CD44、CD90免疫熒光染色陽性（圖1）；CD31、CD45均為陰性（未顯示）。
2.2誘導分化后細胞形態學變化及相關抗原檢測
誘導組細胞內皮方向誘導14d后，見細胞逐漸變大，形態由長梭形、多角形變為扁平多角形，并呈鋪路石樣排列（圖2a）,具有典型內皮細胞形態。誘導組細胞CD31免疫熒光染色均為陽性（圖2b），其陽性表達率＞95%；而對照組細胞形態無明顯變化，仍為大小一致的長梭形或多角形，且CD31免疫熒光染色為陰性（結果未顯示）。
3討論
在治療嚴重缺血性血管疾病的過程中，治療性血管生成是近年來研究的熱點之一。血管生成的自然過程是多種細胞因子協調有序相互作用的復雜過程，而骨髓中干細胞能合成分泌多種促進血管生成的因子［4，5］。說明骨髓可成為在缺血條件下促進新生血管形成的有效材料。已有多項研究表明骨髓中存在的內皮祖細胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）可在一定環境下被誘導為成熟內皮細胞，并能增加缺血組織的新生毛細血管密度［6～10］。并且在臨床實驗中也取得良好效果［11］。這些都為缺血性疾病的治療和血管組織工程種子細胞提供了新的途徑。但目前國內外對于EPCs的分離鑒定尚無統一標準，且EPCs在體外擴增條件要求高，花費大，擴增數量有限，很難較好地滿足當前缺血性疾病治療和組織工程所需種子細胞的要求。故EPCs可能并不是最佳的選擇。
骨髓間充質干細胞是一族具有自我復制和多向分化潛能的細胞,在一定條件下可分化成骨、軟骨、脂肪和內皮細胞等中、內、外胚層細胞。具有易于獲得、能大量擴增等特點，這使得MSCs成為種子細胞新的選擇。本實驗使用密度梯度離心法加貼壁培養法分離并純化骨髓單核細胞，對其進行細胞形態學及表面抗原熒光檢測，結果顯示所得細胞呈長梭形，排列為柵欄狀或螺旋狀，且表達CD44、CD90，同時并不表達CD31、CD45，符合MSCs表現。經過內皮誘導培養14d后，細胞形態發生較大變化，由長梭形變為扁平多角形，細胞呈鋪路石樣排列，且所得細胞高度表達CD31，說明誘導后細胞獲得了內皮細胞的特性，證明了MSCs在VEGF和bFGF誘導下可向內皮細胞方向分化。本研究使用密度梯度離心加貼壁篩選可獲得MSCs，體外誘導可獲得內皮細胞，該法取材方便,操作相對簡單、安全，為MSCs移植治療性血管新生提供實驗依據。但本研究未涉及誘導后細胞生物學性質的研究，這有待在今后的研究中完善。
