So9基因治療椎間盤退變現(xiàn)狀范文

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【關(guān)鍵詞】椎間盤退變性疾病

椎間盤退變性疾病(discdegenerationdisease,DDD)是一種發(fā)病率及致殘率極高的疾病，常引起以頸肩腰腿疼痛為主要表現(xiàn)的臨床癥候群，據(jù)資料表明，DDD患者占美國骨科住院人數(shù)的1/3以上，目前對DDD的常規(guī)治療方法包括藥物治療、理療、臥床休息、類固醇注射封閉以及手術(shù)治療等。但是，這些措施僅能夠改善疾病的臨床癥狀，并不能從根本上減緩或終止退變的進(jìn)程。因此，進(jìn)一步研究椎間盤退變的發(fā)生機(jī)制，試圖從分子水平上對椎間盤退變進(jìn)行調(diào)控，從而對椎間盤退變進(jìn)行治療是非常有價(jià)值的。以往對DDD發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在椎間盤的生物力學(xué)改變、椎間盤的自身免疫因素、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡失衡及椎間盤的營養(yǎng)障礙等幾方面。近期的研究顯示，Sox家族的Sox9基因很可能與椎間盤退變有著密切的關(guān)系，現(xiàn)將其相關(guān)研究情況作一綜述。

1椎間盤退變與膠原改變

椎間盤內(nèi)含有大量的膠原，其中Ⅰ、Ⅱ型膠原是最主要的膠原，約占總量的80%，其次是Ⅵ型膠原，占10%~20%。在正常情況下，Ⅰ型膠原主要存在于外層纖維環(huán)，Ⅱ型膠原則主要分布在髓核和軟骨終板。Ⅱ型膠原，在椎間盤中央含量最高，到邊緣則逐漸減少，而Ⅰ型膠原則剛好相反。而且膠原在椎間盤內(nèi)的分布情況并不隨年齡的增長而改變。但是，隨著椎間盤的退變，膠原的構(gòu)成情況卻發(fā)生了變化。在退變的早期，正常類型的膠原在它們的分布范圍有增加的趨勢，提示在退變早期椎間盤存在一過性修復(fù)反應(yīng)，這一點(diǎn)已經(jīng)在核中軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原mRNA增強(qiáng)表達(dá)得到證實(shí)［1］。髓核中，Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅵ型膠原含量也有增加，Ⅰ型膠原在纖維環(huán)中也呈增加趨勢。隨退變程度的加重，膠原的性質(zhì)發(fā)生了改變，Ⅰ型膠原開始出現(xiàn)在髓核中，軟骨終板喪失了Ⅱ型膠原的表達(dá)。Ⅳ型和Ⅹ型膠原也在髓核中出現(xiàn)，膠原成分的改變說明髓核內(nèi)軟骨樣細(xì)胞表型發(fā)生變化，可能失去了軟骨特征而出現(xiàn)骨化現(xiàn)象。最后，膠原的翻譯后修飾出現(xiàn)非酶糖化或脂質(zhì)過氧化作用，交聯(lián)增加。以上種種變化最終導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞外環(huán)境的破壞，椎間盤的彈性和膨脹時(shí)的抵抗力減弱，這種改變極難自行修復(fù)。

2Sox家族及Sox9基因

1990年，Berta等［2］在人類和小鼠中克隆了睪丸決定因子SRY基因，人們發(fā)現(xiàn)SRY基因產(chǎn)物含有的一個(gè)保守區(qū)與一種染色體蛋白HMG-1和HMG-2中的DNA結(jié)合基序非常相似。HMG框是一個(gè)長約79個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合基序，根據(jù)該HMG框的保守性，由此命名了編碼一類新的轉(zhuǎn)錄因子的基因家族，稱為Sox家族，該家族特點(diǎn)為其所編碼的蛋白質(zhì)與HMG框有60%同源性。2000年，Girard等［3］人利用已經(jīng)克隆的Sox基因全長序列和大量的完整的HMG基序?qū)ox基因家族的分類進(jìn)行了詳細(xì)的研究，他們提出Sox基因家族可以分為A~J十個(gè)亞族。同一亞族內(nèi)不同基因間在HMG基序內(nèi)的相似性在80%以上；不同亞族間的相似性就低于這個(gè)數(shù)字。另外，同一亞族中同一Sox基因在脊椎動(dòng)物中不僅在HMG基序區(qū)存在同源性而且在其他區(qū)也存在較大的相似民生。在哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中，Sox基因在廣泛范圍內(nèi)表達(dá)。Sox1，Sox2，Sox3，Sox9和Sox11在神經(jīng)組織中主同水平表達(dá)；Sox9在軟骨組織中和性腺中表達(dá)；Sox2亦在雞胚胎的晶狀體和腸的表皮細(xì)胞中表達(dá)。

Sox9基因是Sox基因家族成員之一，1994年，Zanaria等［4］克隆了Sox9基因，發(fā)現(xiàn)它與SRY的HMG框區(qū)域的同源性大于60%，基因定位于染色體17q24Ⅱ~25Ⅰ區(qū)段內(nèi)，在男性睪丸的發(fā)育中與SRY基因相同，作為轉(zhuǎn)錄因子而調(diào)控其下游基因的表達(dá)。SRY基因并不是直接調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育而是通過Sox9共同作用才發(fā)生作用。Foster等［5］將從三個(gè)獨(dú)立文庫中分離得到的cDNA克隆序列組裝出Sox9的復(fù)合轉(zhuǎn)錄單位，其長度為3934bp，Sox9基因具有一個(gè)開放閱讀框架（ORF），該框架能夠編碼509個(gè)氨基酸，其中104~182位的79個(gè)氨基酸殘基編碼HMG盒，與SRY基因的HMG盒編碼序列同源性高達(dá)71%；除此之外，在其所編碼的Sox9蛋白C端約1/3處有一富含脯氨酸、谷氨酰胺和絲氨酸的區(qū)域，該區(qū)域類似于某些轉(zhuǎn)達(dá)錄因子的反式激活域（transactivation/transcriptionactivationdomain,TA域），這一非酸性區(qū)域在進(jìn)化上相當(dāng)保守，很可能Sox9蛋白因含有HMG盒樣DNA結(jié)合基序及該TA域而具有轉(zhuǎn)錄因子活性。

3Sox9基因與椎間盤退變

椎間盤的退變與其內(nèi)部的細(xì)胞外基質(zhì)的改變有密切的聯(lián)系。椎間盤的細(xì)胞外基質(zhì)主要由抵抗張力的膠原和抵抗壓力的蛋白多糖共同組成，而細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定是椎間盤結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。因此椎間盤內(nèi)膠原變化，包括膠原的成分和構(gòu)象改變必將影響椎間盤的生物學(xué)性質(zhì)，并且更易造成椎間盤退變［6、7］。Nerlich［8］和Ahsan等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，椎間盤髓核中膠原的類型發(fā)生變化，最初為Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型膠原的增加，隨后為Ⅱ型膠原的喪失；椎間盤內(nèi)蛋白聚糖含量逐漸下降，呈聚集狀態(tài)的蛋白聚糖下降尤為明顯，非聚集蛋白聚糖比例相對增加，這種變化在髓核更為顯著。同時(shí)，伴隨蛋白聚糖的下降，含水量明顯降低。Oegema等［10］發(fā)現(xiàn)，間盤退變后，椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallporoteinases,MMPs）增多，抑制了基質(zhì)合成。其它的研究結(jié)果還顯示［11］，椎間盤的退變過程是由于細(xì)胞因子的減少和致炎因子的增多，導(dǎo)致MMPs活性增加，椎間盤軟骨樣細(xì)胞分泌蛋白聚糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原能力下降、降解加速。進(jìn)而使椎間盤軟骨樣細(xì)胞賴以生存的細(xì)胞外環(huán)境被破壞，髓核內(nèi)水分喪失，不能維持椎間盤內(nèi)應(yīng)有的張力，加劇細(xì)胞退變，并且這種改變很難自行修復(fù)。有資料顯示Sox9、Ⅱ型膠原、aggrecan是最主要的三種軟骨細(xì)胞因子［12~14］，并且Sox9被當(dāng)作Ⅱ型膠原mRNA轉(zhuǎn)錄中的正向操縱了［15~17］；Sive等［18］用原位雜交方法分析了正常與退變椎間盤內(nèi)Sox9、Ⅱ型膠原和蛋白多糖三種軟骨因子的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤的髓核與纖維環(huán)中Sox9與Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)明顯降低。通過免疫定位分析方法發(fā)現(xiàn)椎間盤纖維環(huán)組織中Sox9的表達(dá)水平與年齡呈反比［19］。Paul等［20］在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Sox9腺病毒載體能夠增加細(xì)胞內(nèi)Sox9與Ⅱ型膠原的表達(dá)。同時(shí)在纖維環(huán)穿刺法制備的兔椎間盤退變的病理模型中注射重組腺病毒載體，發(fā)現(xiàn)注射S

ox9腺病毒的椎間盤與注射病毒對照組相比仍能維持更好的軟骨細(xì)胞表型。有學(xué)者更進(jìn)一步的對不同時(shí)期椎間盤（包括新生兒椎間盤，正常椎間盤，退變各個(gè)時(shí)期椎間盤）應(yīng)用RT-PCR、Westernblot和免疫組化方法檢測髓核中Sox9、Ⅱ型膠原基因的表達(dá)，并分析兩者的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Sox9mRNA在椎間盤髓核細(xì)胞中的表達(dá)從新生兒到嚴(yán)重的椎間盤退變的病人逐漸降低，且它在人的椎間盤退變過程中也有表達(dá)，從新生兒到嚴(yán)重退變的椎間盤細(xì)胞中，Ⅱ型膠原下降的幅度與Sox9降低的幅度基本一致，這表明椎間盤退變的發(fā)生一定與Sox9的表達(dá)降低有關(guān)系，Sox9在正向調(diào)控Ⅱ型膠原的合成方面發(fā)揮了重要的作用。另外，1993年，Tommerup等［21］通過對染色體易位斷裂點(diǎn)定位作圖，提出17號(hào)染色體短民Sox9如果發(fā)生突變，就可以導(dǎo)致軀干發(fā)育異常（campomelicdysplasia,CD）。CD是一種罕見的可致死先天性軟骨骼發(fā)育異常綜合征（國外報(bào)道發(fā)病率為05~1/10萬），其典型病狀是先天弓形和長骨扭曲，常合并四肢骨骼異常如先天性脊柱裂、多趾畸形和軟骨形成障礙，患者常因呼吸衰竭而死于出生后的第一個(gè)月內(nèi)，因?yàn)榧膊〉膰?yán)重程度不一，極少數(shù)病人能活到成年。Lefebrve等［22］亦推測在CD患者中Sox9基因活性的降低將抑制Ⅱ型膠原的產(chǎn)生而導(dǎo)致嚴(yán)重的骨骼發(fā)育障礙。昆士蘭大學(xué)的Wright等認(rèn)為小鼠中的一種“短尾突變”實(shí)際上代表一種潛在的CD模式，Sox9是“短尾”鼠中有缺陷的基因，雖然不表現(xiàn)性反轉(zhuǎn)，但這些小鼠應(yīng)當(dāng)也還有一系列其它骨骼發(fā)育上的異常。目前可引起椎間盤退變的各種因素恰恰也是可以誘發(fā)Sox9基因突變的因素，因此我們有理由懷疑，在椎間盤退變過程中，很可能也象“短尾突變”或“CD”一樣，存在Sox9基因的突變。或者即使沒有Sox9基因編碼序列上的突變，也可能存在調(diào)控方面的缺陷。這些都十分值得我們進(jìn)行更深入的研究探索。

4Sox9對Ⅱ型膠原的調(diào)控機(jī)制

雖然，當(dāng)前已經(jīng)確認(rèn)Sox9是Ⅱ型膠原合成過程中的一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，且其在軟骨的發(fā)育、成熟過程中對Ⅱ型膠原的正向調(diào)控作用已十分明確，但其中確切的調(diào)控機(jī)制是什么呢？亦即Sox9是通過什么機(jī)制正向調(diào)控二型膠原蛋白表達(dá)呢？LefebvreV等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原基因（Co12al）的內(nèi)含子Ⅰ中一個(gè)最小的DNA元件引起了轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨特異性細(xì)胞的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該元件在瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中也是一個(gè)軟骨細(xì)胞特異性的強(qiáng)增強(qiáng)子。Co12al的表達(dá)與軟骨細(xì)胞中所表達(dá)的高水平Sox9RNA和Sox9蛋白密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)這個(gè)最小的Co12al增強(qiáng)子是Sox9作用的靶序列，Sox9直接結(jié)合到這個(gè)最小的Co12al增強(qiáng)子的一段序列上并將該軟骨細(xì)胞增強(qiáng)子激活，共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在非軟骨細(xì)胞中，Sox9也是作為一個(gè)有效地增強(qiáng)子激活劑而發(fā)揮作用。LefebvreV設(shè)計(jì)出該增強(qiáng)子的突變體，使其不能與Sox9相結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞中增強(qiáng)子的活性消失，共轉(zhuǎn)染的非軟骨細(xì)胞中由Sox9引起的增強(qiáng)子的激活亦受到抑制。LefebvreV將Sox9蛋白截短，去除其反式激活域（transactivationdomain,TA域）部分但保留其與DNA結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)與全長的Sox9蛋白相比，增強(qiáng)子的活性受到了明顯的抑制。以上試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈的表明Sox9參與了軟骨細(xì)胞中Co12al的細(xì)胞特異性激活作用以及Ⅱ型膠原合成的調(diào)控，且其調(diào)控機(jī)制是通過Sox9蛋白的DNA結(jié)合域與Co12al增強(qiáng)子直接結(jié)合而發(fā)揮作用，而Sox家族的其他成員對該增強(qiáng)子并無激活作用。除了與DNA直接結(jié)合，Sox9是否還通過其他的方式（如信號(hào)通路等）調(diào)控Ⅱ型膠原的表達(dá)呢？目前并無相關(guān)報(bào)道。

總之，椎間盤退變的基因治療正處于早期的實(shí)驗(yàn)階段，對Sox9基因在椎間盤退變中作用和機(jī)制的研究亦剛剛展開。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對椎間盤退變的生物學(xué)機(jī)理研究的不斷深入，相信Sox9基因終將廣泛應(yīng)用到椎間盤退變的臨床治療中。

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