高效液相色譜法測定西司他丁鈉含量及物質范文

本站小編為你精心準備了高效液相色譜法測定西司他丁鈉含量及物質參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

【摘要】目的建立HPLC測定西司他丁鈉的含量和有關物質。方法采用高效液相法色譜(HPLC法)，以C18柱(4.6mm×250mm，5μm)為分析柱，乙腈∶0.1mol/L磷酸銨(用磷酸調pH至6.8)(30∶70)為流動相，檢測波長210nm，流速0.8ml/min，柱溫50℃。結果西司他丁鈉在0.08～0.60mg/ml范圍內與峰面積有良好的線性關系，平均回收率為100.2%(n=9)。西司他丁鈉與相鄰雜質峰完全分離，西司他丁鈉的檢測限為1.8ng，定量限為5.9ng。結論該方法可靠、簡便、準確。可作為西司他丁鈉含量和有關物質的測定方法。

【關鍵詞】西司他丁鈉；高效液相色譜法；有關物質

ABSTRACTObjectiveToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofthecontentandtherelatedsubstancesofcilastatinsodium.MethodThecolumn:C18(4.6mm×250mm,5μm)wasused,themobilephasewasacetonitrileand0.1mol/Lphosphateammonium(adjusttopH6.8withphosphoricacid)(30∶70),thedetectingwavelengthwas210nm,theflowratewas0.8ml/minandthecolumntemperaturewas50℃.ResultsTheaveragerecoverywas100.2%(n=9).Cilastatinsodiumncouldbecompletelyseparatedfromotherimpurities.Limitofdetectionforcilastatinsodiumwas1.8ng.Limitofquantitationforcilastatinsodiumwas5.9ng.ConclusionTheproposedHPLCmethodisreliable,convenientandaccurate.Themethodcanbeusedfordeterminationofcontentandrelatedsubstacesofcilastatinsodium.

KEYWORDSCilastatinsodium;Relatedsubstaces;HPLC

西司他丁鈉(cilastatinsodium，CS)是一種很好的腎去氫肽酶I抑制劑，其本身不具有抗菌活性，對β內酰胺酶也無抑制作用，它是碳青霉烯類藥物亞胺培南(imipenen，IMP)的增效劑。IMP單獨給藥時，經腎小球過濾或分泌后，被近端腎小管上皮細胞刷狀緣中的去氫肽酶I水解失活60%～95%，導致尿中活性藥物濃度降低。CS能阻抑IMP進入腎小管上皮組織，減少IMP的排泄并保護IMP在腎中不被破壞，可防止因IMP引起的腎小管壞死，減輕藥物的腎毒性，增加療效。兩者合用后西司他丁減少IMP被腎小管上皮細胞的去氫肽酶水解，可使IMP的AUC增加20%，在尿中回收的原形藥物多達70%，所以在制劑時IMP/CS以等量配制［1］。

IMP/CS適用于多種細菌的混合感染和需氧/厭氧菌的混合感染以及在尚未確定病原菌前的早期治療，近年廣泛用于抗感染治療，取得滿意結果，已成為治療嚴重感染的一線藥物。

對于原料CS的含量測定，國外藥典采用電位滴定法［2］，國內未見報道。本研究建立HPLC法測定CS含量和有關物質，得到滿意結果，現報道如下。

1儀器與試藥

島津LC2010A型高效液相色譜儀，Watersmillipore真空泵，SB5200型超聲波儀，F13型酸度計，島津MultiSpec1501紫外分光光度計。

CS原料3批(由某藥廠提供；批號20044006、20044007和20044008)；CS對照品(純度97.8%)由河北省藥品檢驗所提供；乙腈為色譜純，磷酸銨、磷酸二氫鉀、鹽酸、30%過氧化氫、氫氧化鈉均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：DiamondC18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈∶0.1mol/L磷酸銨(精密稱取磷酸銨20.31mg，加1000ml水使溶解并稀釋至刻度，用磷酸調至pH6.8)(30∶70)；流速0.8ml/min；檢測波長210nm；柱溫50℃；進樣量20μl，結果見圖1。

1：西司他丁鈉；2、3：未知雜質

圖1西司他丁鈉HPLC有關物質圖譜

2.2系統適用性

(1)柱效與不對稱度取CS對照品溶液進樣，理論塔板數按CS峰計算為7070。

(2)進樣精密度試驗取CS對照品溶液連續進樣5針，其峰面積的RSD為0.008%，表明系統精密度良好。

2.3專屬性

對CS對照品進行高溫、氧化、強酸、強堿的破壞性試驗，以研究其降解產物與主峰的分離情況。

在選定的色譜條件下，取上述破壞后供試品溶液進樣，結果主峰與各雜質峰獲得有效分離，提示氧化和強酸破壞產生較大雜質，高溫和強堿破壞總雜質量和雜質個數變化不大，表明CS在氧化、強酸條件下較不大穩定，強堿和高溫對樣品影響較小。

2.4

準確度

精密稱取CS對照品及已知含量的樣品各三份，分別置于100ml量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，制成含量測定濃度的80%、100%和120%的溶液，搖勻，濾過，進樣，結果低、中、高3個濃度的回收率(n=3)分別為100.1%(RSD=0.28%)、100.8%(RSD=1.24%)和99.8%(RSD=0.53%)；平均回收率為100.2%(n=9)(表1)，表明方法準確度良好。表1回收率測定結果

2.5線性和范圍

精密稱定CS對照品，置25ml容量瓶中，加水使溶解，加至刻度，分別制成0.0793、0.1586、0.3172、0.4758和0.6344mg/ml對照品溶液按“2.1”項色譜條件進行測定，以對照品溶液濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，結果在0.08～0.60mg/ml的濃度范圍呈良好的線性，線性方程為：

y=5.178×107x-1.981×105r=0.9997

2.6方法精密度

同一批樣品，分別進樣6次，依法測定含量，結果含量的RSD為0.08%，表明方法精密度良好。

2.7檢測限和定量限

以信噪比≈3時，注入儀器的量確定CS的檢測限為1.8ng；以信噪比≈10時，確定CS的定量限為5.9ng。

2.8樣品溶液的穩定性

在同一批樣品的溶液，在0、1、2、3、4和5h分別進樣進行考察溶液的穩定性，測得峰面積的積分值，結果RSD為0.78%，表明在室溫(25℃)條件下，溶液放置6h，其主峰面積沒有變化，保留時間也基本沒有變化。因此，CS溶液穩定性好。

2.9重復性試驗

分別平行制備6份CS供試品溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，測得CS的含量。結果顯示RSD為0.58%，說明本實驗方法重復性好(表2)。

2.10有關物質的測定

原料測定溶液的制備精密稱取CS15mg，置25ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1.0ml，置100ml容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

測定方法量取對照品20μl注入液相色譜儀中，調節檢測器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%，再分別精密量取上述各溶液20μl，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖至20min(表3)。

表2重復性測定結果表3有關物質檢測結果

2.11含量測定

對照品溶液的制備精密稱定CS對照品適量，加水溶解并稀釋成每1ml中約含CS0.5mg的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，加水制成每1ml中約含0.3mgCS的溶液，作為供試品溶液。

測定方法取CS原料3批，按上述方法制被測定溶液，各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算CS含量，結果見表4。

取CS原料3批(同上)，用電位滴定法進行試驗，結果見表4。

3討論

(1)流動相的選擇CS的化學名為(Z)7［［(R)2氨基2羧乙基］硫］2［(S)2，2二甲基環丙烷甲酰氨基］2庚烯酸鈉。由于分子結構中含叔胺結構，它易表4含量測定結果與固定相表面殘余硅醇基形成氫鍵，發生次級保留效應，導致拖尾，故應在流動相中加入適當的添加劑，以限制硅醇基團對CS分子的作用。本文選用季胺類離子對試劑磷酸銨。磷酸銨與CS為同種電荷，在本色譜系統中，一方面與溶劑間存在靜電排斥力，另一方面作用于固定相表面，抑制溶劑的親硅醇基團效應，達到改善對稱性，提高柱效，縮短溶質保留時間。在本試驗中曾用0.1mol/L的磷酸溶液，但是同樣濃度下改善峰形的效果遠不如磷酸銨。在流動相中加入較低濃度的磷酸調節pH至6.8，有助于保持峰形的對稱性。在流動相的pH選擇上，曾用pH5.5、pH6.0，、H6.5以及pH6.8但都不及pH6.8，在此條件下，主峰保留時間縮短，柱效明顯增加。有機相選用30%的乙腈與磷酸銨混合，是用來加快CS的出峰時間，降低柱壓，提高柱效，改善主峰與雜質峰的分離度。

(2)檢測波長的選擇取CS對照品適量，用水溶解并稀釋至15μg/ml的溶液。在200～700nm波長范圍內掃描，結果CS在此范圍內無最大吸收波長，但考慮其邊緣效應，同時考慮到其基線噪音的穩定性，故選擇CS和雜質均有較高檢測靈敏度作為測定波長。

(3)柱溫的選擇分別將柱溫設為25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃，結果顯示柱溫對分離影響不大，但升高柱溫可使系統平衡時間縮短，基線穩定性明顯改善，降低了流動相的粘度和柱壓，縮短了保留時間，提高柱效，適當改善峰形，使試驗結果重現性更好。

(4)與電位滴定方法的比較電位滴定法測定CS含量時，共有三個突躍點，計算采用第一和第三突躍之間的滴定數差值。但是它的第一個突躍很不顯著，影響結果的判定，也影響測定準確度。采用高效液相色譜法，簡單、快速且準確度高。

致謝：本文的實驗得到長治醫學院2002級學生張文波和宋鑫鑫兩位同學的大力協助。

【參考文獻】

［1

］張建民，馮玲玲，李勇，等.抗菌藥物增效劑［J］.中國藥師，2003，6(3)：172～173.

［2］TheUnitedStatesPharmacopoeialConventionInc.TheUnitedStatesPharmacopoeiaXXVIII［S］.TheBoardofTrustees,2005:471～472.新晨