MHCC97中邊緣群細胞成瘤性及其侵襲性觀察范文

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作者：張毅，竇科峰，宋文杰，霍斌亮，張福琴

【摘要】目的:分離肝癌細胞系mhcc97中邊緣群細胞并觀察其成瘤性和侵襲性.方法:利用流式細胞熒光激活分選法將肝癌細胞系MHCC97分成邊緣群(SP)和主群(MP)細胞兩個亞群.對兩個亞群細胞分別采用軟瓊脂克隆形成實驗和裸鼠成瘤試驗觀察其體內外成瘤能力；Transwell小室法檢測兩個亞群細胞的體外侵襲力.結果:SP細胞的體外克隆形成率為57%，MP細胞僅為13%；1×103個SP細胞可在4wk后形成明顯的皮下移植瘤(2/8)，MP細胞則需1×105個才能成瘤(2/8).Transwell侵襲試驗結果顯示，SP表型細胞穿過人工基底膜的細胞數為(66.6±4.0)個，MP表型細胞僅為(18.2±1.9)個.結論:肝癌細胞系MHCC97中SP亞群的成瘤性和侵襲性均強于MP亞群細胞，表明SP表型的細胞在肝細胞癌的生長、轉移中具有重要的地位.

【關鍵詞】肝細胞癌；邊緣群；腫瘤干細胞；侵襲

0引言

目前對干細胞和腫瘤細胞之間關系的研究表明：惡性腫瘤是由一小群具有干細胞特性的腫瘤細胞即腫瘤干細胞(cancerstemcell,CSC)［1］引起.CSC在腫瘤形成、生長以及浸潤和轉移中起著決定性作用.我們采用流式細胞熒光激活分選肝癌細胞系MHCC97中邊緣群(SP)亞群和主群(MP)亞群并研究其成瘤性和侵襲性.初步分析邊緣群細胞與肝癌生長和轉移的關系.

1材料和方法

1.1材料MHCC97細胞系(人高轉移肝癌細胞系)購自上海復旦大學中山醫院肝癌研究所.裸小鼠(BALB/c)48只，雌雄兼用，4～6wk齡，體質量l5～18g（本校實驗動物研究中心）；DMEMF12培養基、小牛血清(Gibco公司)；Hoechst33342、維拉帕米、碘化丙錠(PI)(Sigma公司)；FACSAdvantageII型六色熒光流式細胞儀(美國BD公司)；Transwell小室(Costar公司)；Matrigel（BD公司)；纖維粘連蛋白(Sigma公司).

1.2方法

1.2.1MHCC97細胞培養用含100mL/L小牛血清,1×105u/L青霉素,1×105u/L鏈霉素的DMEMF12培養液,在37℃，50mL/LCO2飽和濕度條件下培養MHCC97細胞,2.5g/L胰蛋白酶消化液消化、傳代,實驗選用對數生長期細胞.

1.2.2SP，MP細胞的分選①細胞染色：胰酶消化MHCC97細胞，調整細胞密度為1×106/L.加入熒光染料Hoechst33342使終濃度為6mg/L.取1/10體積加好染料的細胞懸液加入維拉帕米，終濃度50μmol/L.37℃避光水浴90min，冰上10min.分選前制備成單細胞懸液，加入PI至終濃度為2mg/L.②流式細胞儀檢測：355nmUV激發光源，610nm雙色短通反射濾鏡，450nm和675nm邊緣長通濾片分別檢測散射光藍光及紅光部分.測量前向散射(FSC)和側向散射(SSC)二維參數圖，檢測細胞均一性，以Hoechstred為X軸，Hoechstblue為Y軸作二維散點圖，將低Hoechstred及低Hoechstblue且維拉帕米組缺失的區域設定為SP細胞的“門”，計算百分比，分選出SP，MP細胞.

1.2.3雙層軟瓊脂集落形成率實驗于24孔板中,下層低熔點瓊脂濃度為6g/L,上層為3g/L,每孔上層低熔點瓊脂含細胞數為100個,SP，MP細胞各鋪5孔.在37℃，50mL/LCO2及飽和濕度環境下培養2wk，倒置顯微鏡下計數直徑大于100μm或含24個細胞以上的克隆.計算克隆形成率=克隆形成數/接種細胞數×100%.

1.2.4裸鼠成瘤試驗將分選的SP，MP細胞計數，倍比稀釋法調整濃度，按1×105，1×104，1×103的數量行裸鼠背部皮下接種注射，每個濃度組8只，每3d觀察1次腫瘤形成情況及測量腫瘤大小,連續觀測4wk.

1.2.5細胞侵襲力檢測采用帶有8μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室，在濾膜的上下表面分別鋪以Matrigel和纖維粘連蛋白，上室加1×109/L腫瘤細胞懸液400μL，下室加入200μL條件培養液，于37℃，50mL/LCO2培養24h，用棉簽擦去微孔膜上室面的細胞，甲醛固定，HE染色，400倍顯微鏡下隨機選擇5個視野，統計視野中細胞數，以侵襲細胞的相對數表示腫瘤細胞的侵襲能力.每組重復試驗3次.

統計學處理:計量資料用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，應用SPSS12.0軟件處理.

2結果

2.1SP細胞和MP細胞的分選前向散射和側向散射二維參數圖分析癌細胞形態、大小、胞質均勻性較一致，PI染色去除死細胞.Hoechst33342藍光和紅光的雙參數圖中SP細胞位于左下角兩種熒光均陰性或很弱的區域,無維拉帕米組SP細胞比例約為3.9%（圖1）,經維拉帕米阻斷后SP細胞比例減少至0.5%.

2.2軟瓊脂集落形成率實驗SP和MP細胞在軟瓊脂培養基中培養2wk后均可見明顯的桑椹樣細胞克隆形成.但在細胞克隆的大小和克隆形成率上MP細胞明顯小于SP細胞.計數24個細胞以上的克隆細胞團，SP組為57%，MP組僅為13%（圖2）.圖1流式細胞分選圖

A：SP；B：MP.

圖2MHCC97邊緣群（SP）和主群（MP）細胞15d形成的克隆×100

2.3裸鼠成瘤試驗接種1×103的SP細胞便可在4wk后形成明顯的皮下移植瘤(2/8)；1×104SP組中有6只裸鼠成瘤；1×105SP組全部成瘤.MP細胞需1×105細胞才能形成皮下移植瘤(2/8)，1×104和1×103MP組均不能成瘤.在相同接種細胞數量的情況下，SP細胞形成的腫瘤體積大于MP細胞(圖3).常規HE染色可見裸鼠皮下腫瘤呈典型的移植瘤特點.

2.4細胞侵襲力檢測SP表型細胞穿過人工基底膜的細胞數為（66.6±4.0）個，MP表型細胞僅為（18.2±1.9）個.兩組間差異有統計學意義（P<0.01).A:1×105SP;B:1×104SP;C:1×103SP;D:1×105MP.

圖3MHCC97邊緣群（SP）和主群（MP）細胞30d成瘤

3討論

目前利用干細胞通用分子標記ABC轉運蛋白(ATPbindingcassettetransporter)高效外排熒光染料的特性進行SP細胞分選［2-3］.2004年，Kondo等［4］在C6，MCF7，Blo4和Hela4個細胞系中檢測到了SP細胞，并提示SP是適用于腫瘤干細胞檢測與分選的一種方法.我們對肝癌細胞系MHCC97流式分選出SP和MP細胞兩個亞群.從實驗數據上看，無論是軟瓊脂克隆形成的體外實驗還是裸鼠成瘤的體內實驗，SP細胞均表現出明顯強于MP細胞的增殖和成瘤能力.這與造血系統、人乳腺癌及神經系統腫瘤中腫瘤干細胞比非干細胞具有更高的成瘤潛能一致［5-6］.但實驗中1×105MP組也有腫瘤形成，其原因可能是這種通過干細胞功能學標志得到得SP亞群并不能代表所有的腫瘤干細胞.

Tu等［7］認為干細胞的遷移和癌細胞的轉移皆受特異化學因子及其受體的調節.干細胞能夠遷移到特定的組織和器官，而這可以解釋腫瘤轉移也有一定器官和組織特異性.Ho等［8］也證實在肺癌中SP亞群細胞具有強于其它細胞的侵襲能力.目前利用Matrigel膠重建基底膜系統是體外研究腫瘤細胞侵襲和轉移行為的簡便且快速的方法［9］.細胞侵襲穿過重建Matrigel的能力反映該細胞的侵襲能力.實驗結果表明SP細胞24h穿過人工基底膜的細胞數遠多于MP亞群.提示SP亞群細胞的存在可能是導致肝癌轉移和復發的主要原因之一.

我們的結果表明，肝癌細胞系MHCC97中SP亞群細胞具有很強的成瘤性和侵襲性，也表明其具有一定的干細胞特性.與上述結論相關的具體分子機制及直接因果關系還有待進一步探討，目前尚不能證明SP亞群中百分之百的細胞都具有干細胞特性，同時并非所有腫瘤干細胞都具有SP特性［10］.若結合其他干細胞表面標志如Sca1，ckit，CK7，Thy1［11］可進一步純化具有干細胞特性的肝癌細胞.總之，針對具有干細胞特性的SP亞群細胞的研究將在肝癌的治療中具有重要的臨床意義.

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