chk2反義寡核苷酸對順鉑誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡范文

本站小編為你精心準備了chk2反義寡核苷酸對順鉑誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

作者：朱克修，李玢，王佳，韓曉兵

【摘要】目的：觀察卵巢癌SKOV3細胞轉染chk2反義寡核苷酸后在順鉑作用下細胞凋亡的變化.方法：用MTT法檢測不同濃度順鉑對SKOV3細胞的抑制率，WesternBlot法檢測SKOV3細胞中Chk2蛋白的表達.流式細胞儀及TUNEL法檢測轉染chk2反義寡核苷酸后順鉑作用下SKOV3細胞凋亡情況.結果：順鉑對SKOV3細胞的生長抑制率隨濃度增高和時間延長而升高.WesternBlot法檢測證實轉染chk2反義寡核苷酸后SKOV3細胞中Chk2蛋白表達受到明顯抑制.流式細胞儀檢測抑制chk2基因表達后SKOV3細胞凋亡率為（77.6±1.7）%，明顯高于正常組（24.7±1.76）%，空脂質體組（35.6±1.4）%及轉染正義寡核苷酸細胞組（47.6±1.2）%.TUNEL法檢測結果與流式細胞法一致.結論：chk2可作為卵巢癌增敏治療的有效靶點.

【關鍵詞】chk2基因；反義核酸技術；卵巢腫瘤；順鉑

0引言

腫瘤細胞的多耐藥性已成為惡性腫瘤化療失敗的重要原因［1］，進行化療增敏或尋找新的治療手段具有重要意義.細胞周期檢測點是增強腫瘤治療敏感性研究的熱點之一［2］.腫瘤的耐藥與腫瘤細胞逃避放化療誘導的腫瘤細胞凋亡有關，因為放化療作用下可使細胞周期檢測點激活，導致細胞周期停滯和細胞的損傷修復，從而使腫瘤細胞避免凋亡.周期檢測點激酶1，2（checkpointkinase1，2，Chk1，Chk2）是細胞周期檢測點中最關鍵的效應蛋白酶［3］.國外一些研究表明，轉染chk1/chk2反義寡核苷酸可明顯提高一些腫瘤模型對抗腫瘤藥物的敏感性，說明chk1/chk2可能是一些腫瘤增敏治療的有效靶點［4］.本研究通過檢測chk2反義寡核苷酸對順鉑誘導的SKOV3細胞凋亡的影響，以探討chk2能否作為卵巢癌增敏治療的有效靶點.

1材料和方法

1.1材料skov3細胞株由西安交通大學臨床醫學研究分子中心提供.RPMI1640購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑藍（MTT）購自Amressco公司，轉染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，鼠抗人Chk2mAb購自NEOMARKERS公司，辣根酶標記羊抗鼠二抗購自博士德公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購自華美生物工程公司.

1.2方法

1.2.1細胞培養人卵巢癌細胞SKOV3常規培養在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養基中，培養條件為37℃，50mL/LCO2飽和濕度，待細胞長滿瓶底時，2.5g/L胰蛋白酶消化傳代.

1.2.2MTT法測定不同濃度順鉑在不同時間對SKOV3細胞生長的抑制率取對數生長期的SKOV3細胞，調整細胞密度為5×107/L，接種于96孔板,200μL/孔,37℃，50mL/LCO2培養箱中培養24h后加藥，使順鉑終濃度為10，20，40，80，160μmol/L,每個濃度設四個平行孔，并同時設不加藥物的陰性對照和無細胞的空白對照，分別于作用24，48，72h后加入20mmol的MTT溶液，20μL/孔，繼續培養4h后，吸去上清，加入DMSO，150μL/孔，振蕩器震蕩10min，使結晶溶解完全，用酶標儀(650BIORAD公司)在490nm處測量A值，計算細胞增殖抑制率（inhibitionrate,IR%）.繪制順鉑對SKOV3細胞的生長抑制曲線.

1.2.3脂質體介導寡核苷酸轉染SKOV3細胞株

1.2.3.1寡核苷酸鏈的設計和合成根據文獻［5］合成chk2的反義寡核苷酸鏈（antisenseoligodeoxynucleotide，Adosn:5′TCCACAGGCACCACTTCC3′）,并同時合成其正義的寡核苷酸鏈(oligodeoxynucleotide,odn:5′GGAAGTGGTGCCTGTGGA3′)作為對照.均采用全硫代修飾，其中部分寡核苷酸鏈的5′端以FITC標記.

1.2.3.2實驗分組與轉染細胞分4組,A：正常組：未經任何處理；B：轉染空脂質體組(LP);C：轉染chk2正義鏈組（chk2odn組）；D：轉染chk2反義鏈組（chk2Asodn組）.B至D兩組在轉染終止10h后同樣用40μmol/L順鉑處理細胞24h.

1.2.3.3轉染效率的測定于轉染前一日用無抗生素的含10mL/L胎牛血清的RPMI1640調整細胞密度為2.5×108/L，接種于24孔板，500μL/孔.轉染當天細胞密度達到90%~95%，并換為500μL無抗生素無血清RPMI1640培養.分別取不同量的熒光標記的寡核苷酸鏈(0.6，0.8，1.0μg)加到50μL的RPMI1640中，混勻.再取2μL的Lipofectamine2000，加到50μL的RPMI1640中，混勻.室溫放置5min后，將分別混有寡核苷酸鏈和Lipofectamine2000的RPMI1640混合，室溫放置20min（寡核苷酸鏈與脂質體比值分別為0.6μg∶2μL，0.8μg∶2μL和1.0μg∶2μL）.將上述混合物加入24孔板中，輕輕混勻，放37℃，50mL/LCO2培養箱中，培養6h后將培養基換為500μL含100mL/L胎牛血清的RPMI1640，繼續培養至24h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉染效率.

1.2.4WesternBlot法檢測Chk2蛋白的表達用酶抑制劑法提取細胞總蛋白，并用Bradford比色法作蛋白定量，煮沸5min使蛋白變性，120g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，轉膜，加入1∶400稀釋的鼠抗人Chk2mAb，室溫孵

育1.5h，TBST洗膜3min，6次.加入1∶3000稀釋的辣根酶標記的羊抗鼠二抗室溫孵育1h，TBST洗膜3min，6次.ECL(購自Amershambioscience)顯色，X光膠片暴光，洗片，掃描存檔.

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡收集細胞，調整細胞密度為1×109/L，取1mL細胞懸液，離心，PBS洗滌3次,加10μLAnnexinVFITC,輕輕混勻，加入5μLPI避光室溫反應15min，上流式細胞儀（EPLCSELITECOULTERCORPORATION公司）檢測.

1.2.6TUNEL法檢測細胞凋亡將SKOV3單細胞懸液接種于24孔培養板培養，使細胞爬于蓋玻片，按前述分組處理細胞后撈出蓋玻片，多聚甲醛固定，按TUNEL試劑盒說明進行操作.

統計學處理:實驗結果均采用SPSS13.0軟件進行方差分析及兩兩比較.P<0.05為差異有統計學意義.

2結果

2.1順鉑對SKOV3細胞的生長抑制作用對照組SKOV3細胞體外生長良好，10，20，40，80，160μmol/L順鉑對SKOV3細胞均有明顯的抑制效應（P<0.05）,10μmol/L順鉑作用SKOV3細胞24，48，72h后的抑制率分別為29.1%，18.2%，50.4%，160μmol/L順鉑作用SKOV3細胞24，48，72h后的抑制率分別為78.9%，78.5%，88.4%.隨著時間延長和濃度增加，其抑制作用越來越明顯（圖1）.DDP作用24h的IC50值為37.2μmol/L.

圖1順鉑對卵巢癌SKOV3細胞株生長抑制曲線

2.2chk2反義寡核苷酸轉染SKOV3細胞的效率用FITC標記的寡核苷酸轉染SKOV3細胞，24h后用熒光倒置顯微鏡觀察轉染效率，發現DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為0.6μg∶2μL，0.8μg∶2μL和1.0μg∶2μL時的轉染效率分別為98.2%，98.9%和99.3%，其中DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為1.0μg∶2μL時轉染效率最高（圖2）.

A:DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為0.6μg∶2μL；B:DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為0.8μg∶2μL；C:DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為1.0μg∶2μL；A1,B1,C1:光鏡檢測；A2,B2,C2:熒光倒置顯微鏡檢測.

圖2不同比率的DNA/Lipofectamine2000脂質體轉染效率×20

2.3轉染chk2反義寡核苷酸對Chk2蛋白表達的影響WesternBlot檢測結果顯示其灰度值分別為1.26，0.76，0.29，0.06,可見轉染chk2反義寡核苷酸可明顯抑制Chk2蛋白的表達（圖3）.與空白對照組，空脂質體組和轉染chk2正義鏈組比較差異有統計學意義（P<0.01）.

A:正常組；B:轉染空脂質體組(LP);C:轉染chk2正義鏈組（chk2odn組）；D:轉染chk2反義鏈組（chk2Asodn組）.

圖3chk2反義寡核苷酸對SKOV3細胞Chk2蛋白表達的影響

2.4轉染chk2反義寡核苷酸對SKOV3細胞早期凋亡的影響40μmol/L順鉑處理各組細胞24h后，流式細胞儀檢測轉染chk2反義鏈組細胞凋亡率為（77.6±1.7）%，明顯高于正常組（24.7±1.76）%，空脂質體組（35.6±1.4）%及轉染正義寡核苷酸細胞組（47.6±1.2）%（P<0.05）.說明轉染chk2反義寡核苷酸可誘導SKOV3細胞的凋亡增加.TUNEL染色后，轉染chk2反義寡核苷酸鏈后SKOV3細胞在順鉑作用下凋亡細胞數明顯高于正常組，空脂質體組和轉染chk2正義寡核苷酸鏈組凋亡細胞數（圖4）.檢測結果與AnnexinV/PI流式細胞儀檢測法獲得結果一致.

A：正常組；B：轉染空脂質體組(LP)；C：轉染chk2正義鏈組（chk2odn組）；D：轉染chk2反義鏈組（chk2Asodn組）.

圖4TUNEL法檢測順鉑處理24h后各組細胞的凋亡×40

3討論

由于對卵巢癌仍缺乏有效的早期診斷方法，多數患者確診時已屬晚期，卵巢癌亦成為死亡率最高的婦科惡性腫瘤.手術治療后輔以化學治療是目前卵巢癌的標準治療方案，然而，腫瘤對化療藥物的耐藥常導致治療失敗.有報道約15%的卵巢癌患者對化療原發性耐藥，至少80%的卵巢癌患者最終形成多種藥物聯合化療的耐藥.研究發現，腫瘤細胞的多耐藥性以成為惡性腫瘤化療失敗的重要原因之一［1］，因而進行化療增敏或尋找新的治療手段具有重要意義.

chk1/chk2在細胞周期檢測點中起重要作用.國外一些研究表明通過阻斷chk1/chk2可以明顯增加腫瘤細胞的凋亡［6-8］.大量研究表明，chk1,2主要在G2/M期檢測點發揮作用［9］.DNA受損后，活化的chkl/2磷酸化CDC25上的Sevr216，使其形成與1433蛋白質結合的位點，從而阻止CDC25的去磷酸化作用.如此cdc2因未脫磷酸化不具活性最終影響cdc2與CyclinB構成的活性復合體從而引起G2M期阻滯［10-11］.卵巢癌細胞對化療藥物的耐藥是治療失敗的重要原因.為了證明chk2是否是卵巢癌增敏治療的有效靶點，通過反義寡核苷酸雜交技術，合成chk2反義寡核苷酸鏈，經過雜交，用WesternBlot法檢測Chk2蛋白在腫瘤細胞中的表達情況.并用順鉑處理雜交后細胞，通過流式細胞術檢測，比較其與其他對照組腫瘤細胞凋亡率的改變情況.我們的實驗結果表明，通過阻斷chk2，可明顯增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性.

本研究首先用MTT法檢測不同濃度的順鉑在不同時間點對卵巢癌SKOV3細胞的抑制率的變化.通過本試驗，我們了解到順鉑對SKOV3細胞的抑制率隨時間和濃度的增加上升.并計算出DDP作用24h的IC50值為37.2μmol/L.所以我們在后面的實驗中均選擇用40μmol/L順鉑處理SKOV3細胞24小時.并通過檢測chk2反義寡核苷酸轉染細胞的效率，獲得一個最佳的寡核苷酸和脂質體的比例，使實驗結果更加穩定可靠.以上結果表明DNA/Lipofectamine2000脂質體比率為0.6μg/2μL,0.8μg/2μL和1.0μg/2μL時的轉染效率均接近100%.我們選擇寡核苷酸/Lipofectamine2000脂質體比率為0.8μg/2μL來轉染SKOV3細胞.轉染后，用WesternBlot法檢測各組SKOV3細胞的Chk2蛋白表達情況，發現轉染chk2反義寡核苷酸鏈組chk2蛋白的表達明顯降低.用40μmol/L順鉑處理SKOV3細胞24h后，用流式細胞儀及TUNEL法檢測顯示轉染chk2反義寡核苷酸鏈組SKOV3細胞的凋亡率明顯增加（P<0.05）.證明了阻斷chk2來增加宮頸癌對順鉑敏感性的有效性.

綜上所述，采用反義寡核苷酸可以有效地抑制Chk2蛋白的表達，并增加順鉑誘導的SKOV3細胞的凋亡.因此，本試驗結果可以證明chk2可以作為卵巢癌增敏治療的有效靶點.

【參考文獻】

［1］王世閬.卵巢疾病［M］.北京：人民衛生出版社，2004：329-333.

［2］MeloJ,ToczyskiD.AunifiedviewoftheDNAdamagecheckpoint［J］.CurrOpininCellBiol,2002,14:237-245.

［3］WalworthNC.DNAdamage:Chk1andCdc25,morethanmeetstheeye［J］.CurrOpinGenetDev,2001;11:78-82.

［4］HiroseY,BergerMS,PieperRO.AbrogationoftheChk1mediatedG(2)checkpointpathwaypotentiatestemozolomideinducedtoxicityinap53independentmannerinhumanglioblastomacells［J］.CancerRes,2001,61:5843-5849.

［5］HuBC,HouXY,WangX,etal.TheradioresistancetokillingofA125cellsderivesfromactivationoftheChk1pathway［J］.BiolChem,2001,276(21):17693-17698.

［6］RouseJ,JacksonSP.Interfacesbetweenthedetection,signaling,andrepairofDNAdamage［J］.Science,2002,297(5581):547-551.

［7］CaporaliS,FalcinelliS,StaraceG,etal.DNAdamageinducedbytemozolomidesignalstobothATMandATR:Roleofthemismatchrepairsystem［J］.MolPharmacol,2004,66(3):478-491.

［8］ZhuW,ChenY,DuttaA.Rereplicationbydepletionofgemininisseenregardlessofp53statusandactivatesaG2/Mcheckpoint［J］.MolCellBiol,2004,24(16):7140-7150.

［9］AhnJ,UristM,PrivesC.TheChk2proteinkinase［J］.DNARepair,2004,3(89):1039-1047.

［10］MatsuokaS,HuangMX,ElledgeSJ,etal.LinkageofATMtocellcycleregulationbytheChk2proteinkinase［J］.Science,1998,282(5395):1893-1897.

［11］BuscemiG,SavioC,ZanniniL,etal.Chk2activationdependenceonNbs1afterDNAdamage［J］.MolCellBiol,2001,21（15）:5214-5122.新晨