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1材料與方法
1.1藥品、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物何首烏飲方劑購(gòu)自承德市肛腸醫(yī)院；D-半乳糖購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司；PCNA購(gòu)自中杉金橋生物試劑公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche生物試劑公司。清潔級(jí)8周齡雄性SD大鼠，體重180～220g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物合格證號(hào)：605106。
1.2何首烏飲藥物溶液的制備何首烏飲方劑組成:何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓按質(zhì)量比3∶2∶3∶2∶5∶3比例混合，水浸泡1h，然后水煎2次，30min/次，過(guò)濾后濃縮至含生藥分別為0.75，1.5，3.0g·ml-1（分別作為低、中、高劑量藥液）。4℃保存，給藥前復(fù)溫至25～30℃。
1.3造模及實(shí)驗(yàn)分組50只SD大鼠隨機(jī)分成陰性對(duì)照組、模型組、何首烏飲低、中、高劑量組（10，20，40g·kg-1·d-1），每組10只。陰性對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水，其余4組大鼠腹腔注射D-半乳糖300mg·kg-1(用生理鹽水配制成6%的溶液)，連續(xù)60d，制備亞急性衰老大鼠模型［2］。給藥組在造模第1日起同時(shí)每天一次灌胃何首烏飲，連續(xù)60d；陰性對(duì)照組和模型組灌胃等體積的生理鹽水。
1.4檢測(cè)方法
1.4.1采用免疫組織化學(xué)S-P法按照免疫組化常規(guī)步驟操作。石蠟切片的抗原修復(fù)采用pH6.0的檸檬酸抗原修復(fù)液，加熱至沸騰后5min緩慢冷卻；PCNA(抗體稀釋比1∶200)4℃過(guò)夜。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。
1.4.2原位末端標(biāo)記法(TUNEL染色法)將切片貼附于多聚賴(lài)氨酸處理過(guò)的載玻片上，切片常規(guī)脫蠟至水，各步驟按TUNEL試劑盒操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。以不含末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的液體代替TUNEL混合液作陰性對(duì)照。
1.4.3結(jié)果判定PCNA及TUNEL染色標(biāo)本細(xì)胞胞核染成棕黃色粗顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。在顯微鏡(400×)下，每張切片上隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每組計(jì)數(shù)3只動(dòng)物，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)3張切片，計(jì)算每個(gè)視野的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
1.4.4數(shù)據(jù)處理Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SPSS13.0軟件分析，單因素方差分析比較組間差異。
2結(jié)果
2.1免疫組化染色結(jié)果各組切片均可見(jiàn)PCNA染色，免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞核，通常呈棕黃色顆粒狀，小部分呈彌散狀。免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腎小管，腎小球有少量表達(dá)。模型組大鼠腎臟PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于陰性對(duì)照組大鼠，何首烏飲各劑量組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。
2.2TUNEL染色結(jié)果TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞，腎小球僅有少量表達(dá)。模型組大鼠中凋亡細(xì)胞成簇存在，而在用藥組散在分布。模型組大鼠腎臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于陰性對(duì)照組，何首烏飲各劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。
表1各組大鼠腎臟PCNA和TUNEL結(jié)果比較（略）
與陰性對(duì)照組比較，▼P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；n=9
2.3PCNA和TUNEL的相互關(guān)系經(jīng)相關(guān)分析PCNA和TUNEL具有負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.912，P=0.000）。
3討論
近年來(lái)延緩衰老以及老年病的預(yù)防已成為國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)，尋找有效的抗衰老藥物是衰老研究中的一個(gè)重要方面。由于化學(xué)藥物的廣泛使用及其毒副作用，研究的方向已矚目于傳統(tǒng)中藥。何首烏飲由何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓組成。何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝能填精補(bǔ)髓、烏發(fā)延年，淫羊藿補(bǔ)腎壯陽(yáng)以強(qiáng)筋骨，丹參活血化淤以通心脈，茯苓健脾利濕以寧心神。近年研究發(fā)現(xiàn)何首烏、淫羊藿、丹參、肉蓯蓉等具有改善脂肪代謝、抗衰老等作用［3］。
增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種只出現(xiàn)在增殖狀態(tài)細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)，其表達(dá)合成與細(xì)胞增殖周期相關(guān)，由G1期開(kāi)始，于S期達(dá)到高峰，至G2期及M期則明顯減少［4］。此外它是DNA聚合酶δ的輔因子/輔蛋白，在細(xì)胞分裂過(guò)程中為DNA合成所必需，協(xié)調(diào)DNA前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成［5］，因此可以作為一項(xiàng)評(píng)估細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)［6］。于會(huì)民等［7］研究發(fā)現(xiàn)生物素通過(guò)提高增殖細(xì)胞核抗原的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)其翻譯和合成水平，促進(jìn)脾臟細(xì)胞DNA的合成，從而促進(jìn)其細(xì)胞增殖與分化。陳志宏等［8］研究發(fā)現(xiàn)用天年飲灌胃后，睪丸PCNA陽(yáng)性生精細(xì)胞明顯增多。本研究顯示，PCNA蛋白在何首烏飲各劑量組表達(dá)均高于模型組，其中何首烏飲高劑量組的表達(dá)最高。提示何首烏飲可以提高細(xì)胞PCNA蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受到生理或病理刺激后在基因控制和酶促反應(yīng)下按一定程序進(jìn)行的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程［9］。可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的數(shù)目，在胚胎發(fā)育、器官保持自身動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中，發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)TUNEL法結(jié)果顯示模型組大鼠中凋亡細(xì)胞成簇存在，而在用藥組只見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞。何首烏飲各劑量組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于模型組(P<0.05)。龐曉靜等［10］報(bào)道天年飲灌胃后，垂體前葉凋亡細(xì)胞明顯減少，陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)與模型組、對(duì)照組比較均有顯著差異（P<0.01），與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
凋亡與增殖是生物體內(nèi)重要的生命現(xiàn)象兩者之間存在著重要的關(guān)聯(lián)。兩者都是一系列基因產(chǎn)物協(xié)調(diào)表達(dá)的結(jié)果，其動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于保持機(jī)體的穩(wěn)定起著重要的作用，其動(dòng)態(tài)失調(diào)和機(jī)體的衰老過(guò)程及疾病的發(fā)生都有著密切的關(guān)系。何首烏飲一方面可明顯提高衰老大鼠腎臟PCNA陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)，起到了促進(jìn)細(xì)胞的增殖的作用另一方面又可以抑制細(xì)胞的凋亡，因此何首烏飲可部分保護(hù)衰老大鼠的腎臟，具有一定延緩衰老的作用。但是衰老與增殖凋亡的關(guān)系極其復(fù)雜亦與各種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)系密切，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。