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1器材與方法
1.1動物與分組選用體重45～50g，鼠齡22d的未成年Wistar雌鼠（清潔級）20只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為實驗組和生理鹽水對照組兩組。
1.2試劑與儀器一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體、購于santacruze公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購于北京中山生物技術(shù)有限公司。LEICARM2125石蠟切片機（萊卡上海分公司），Nikon尼康光鏡顯微照相機（日本株式會社尼康），Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。
1.3OHSS大鼠模型的建立按改良的Ujioka方法［1］在未成年鼠體內(nèi)建立OHSS模型。每只大鼠從第22日齡起連續(xù)4d皮下注射含有10IU妊娠雌馬血清促性腺激素(pregnancymareserumgonadotropin,PMSG,天津?qū)嶒瀯游镏行?的生理鹽水0.2ml,第5天(最后一次注射PMSG后24h)注射含有100IUHCG(麗珠制藥廠)的生理鹽水0.2ml。48h后卵巢顯著增大,表面紫褐色,有多個卵泡形成,出現(xiàn)腹水表明建立了大鼠OHSS模型。對照組同期皮下注射等量生理鹽水。
1.4標本采集和貯存HCG注射72h后即29d齡時，肌肉注射氯氨酮（0.1mg/kg）麻醉大鼠，尾靜脈注射1%的EvansBlue(EB,Sigma)0.1ml。30min后從大鼠眼眶采血1ml入抗凝管，離心（3000r/min，10min）取血漿-20℃保存?zhèn)錂z。另采血1ml于試管中，待血液標本凝固后，離心（3000r/min，10min）吸取血清-20℃保存?zhèn)錂z。脫頸處死大鼠。正中切開腹腔，觀察有無腹水,然后按照Ujioka［2］和Khanna［3］的改良方法用5ml生理鹽水沖洗腹腔。將沖洗液收集到試管中,稀釋至10ml,加0.1mol/L氫氧化鈉0.05ml過濾,并以3000r/min的速度在室溫下離心10min。然后用分光光度計(國產(chǎn)721型)在波長590nm測定OD值。隨后取出雙側(cè)卵巢組織，用生理鹽水清洗干凈。用4%多聚甲醛固定24h后,常規(guī)石蠟包埋,5～7μm連續(xù)切片,用于免疫組化染色。
1.5觀察指標
1.5.1腹腔毛細血管通透性根據(jù)標準濃度及其OD值繪制標準曲線,算出腹腔沖洗液EB的含量。
1.5.2VEGF和IL-6蛋白質(zhì)水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）。大鼠外周血清VEGF測定定量試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，靈敏度為3pg/ml，板內(nèi)板間變異系數(shù)均<9.5%。血漿IL-6定量試劑盒購自上海雄森科技實業(yè)有限公司,檢測方法按照說明書進行。每個樣品均設(shè)2個復孔,重復3次試驗,結(jié)果用MK2型酶標儀讀取吸光值，繪標準曲線求相應(yīng)值（pg/ml）。
1.5.3VEGF和IL-6蛋白質(zhì)免疫組化染色采用SP法。一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體購于santacruze公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購于北京中山生物技術(shù)有限公司，具體操作過程按說明書進行,DAB顯色,蘇木素復染。每組試驗重復至少3次。用PBS代替一抗作為陰性對照。
1.5.4免疫組化結(jié)果判斷光鏡下觀察和圖像分析,VEGF定位于黃體細胞,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。Il-6在卵巢和子宮內(nèi)膜均有表達。選用同批染色切片,每張切片隨機選取5個視野(200×),Nikon尼康光鏡顯微照相機采樣，圖像掃存后Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)測定平均光密度進行分析。
1.6卵巢過度刺激綜合征診斷標準根據(jù)Golan［4］標準,卵巢體積增大、腹腔毛細血管的通透性增加和腹水均出現(xiàn)方可診斷為卵巢過度刺激綜合征。
1.7統(tǒng)計學處理統(tǒng)計方法所有計量資料采用±s表示,均數(shù)差異的顯著性采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析,P<0.05表示在統(tǒng)計學上有顯著性差異。
2結(jié)果
2.1OHSS大鼠腹水EB含量的變化OHSS大鼠腹腔EB含量卵巢過度刺激組腹腔EB含量顯著高于對照組，在統(tǒng)計學上有顯著性差異（P<0.05）。見表1。
2.2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改變OHSS大鼠血中VEGF和IL-6含量顯著高于對照組，在統(tǒng)計學上有顯著性差異（P<0.05），見表2。
表1OHSS對大鼠腹腔EB含量的影響（略）
與對照組比較,*P<0.05;n=10
表2OHSS大鼠血中VEGF和IL-6的改變（略）
與對照組比較,*P<0.05；n=10
2.3OHSS大鼠卵巢和子宮中VEGF和IL-6的改變大鼠卵巢和子宮切片經(jīng)免疫組化染色光鏡下觀察，實驗組VEGF在卵巢黃體、子宮內(nèi)膜和腺體上皮均有表達，IL-6在卵巢黃體和子宮內(nèi)膜均有表達，免疫組化染色陽性細胞較對照組表達較強，經(jīng)Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)分析光密度較對照組在統(tǒng)計學上有顯著性差異（P<0.05）。見表3。
表3OHSS大鼠卵巢和子宮中VEGF和IL-6的免疫組化光密度值（略）
與對照組比較,*P<0.05；n=10
3討論
OHSS是一種醫(yī)源性疾病,是指促性腺激素HMG/HCG誘發(fā)排卵而引起的證候群,嚴重的OHSS甚可危及生命。由于近30年來生殖內(nèi)分泌研究進展甚速,助孕技術(shù)在臨床上被廣泛應(yīng)用,藥物誘發(fā)排卵、超排卵引起OHSS發(fā)生率亦有所上升,如何有效地控制疾病的發(fā)展、同時提高患者受孕率成為新的課題。近來研究表明,VEGF是一種特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能細胞因子,具有增加微血管與小靜脈通透性、促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖等作用［5］。
本研究通過在未成年鼠體內(nèi)建立OHSS模型,此時卵巢顯著增大,表面紫褐色,有多個卵泡形成,有腹水形成,表明成功建立了OHSS模型。本研究顯示，實驗組血中VEGF和IL-6含量增高，VEGF和IL-6在卵巢和子宮內(nèi)膜均有表達，較對照組在統(tǒng)計學上有顯著性差異。表明在OHSS中,無論是多個卵泡發(fā)育和卵子的成熟,排卵后黃體的生成等,均可能導致卵巢和子宮產(chǎn)生和分泌大量的VEGF和IL-6，從而產(chǎn)生局部和全身相關(guān)的病理改變，但其發(fā)病的具體機理目前尚未明了,有待于進一步研究，從而為臨床上進一步治療OHSS奠定實驗學基礎(chǔ)。