佛手種質資源遺傳范文

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1器材和方法

1.1材料佛手CitrusmedicaL.var.sarcodactylis(Noot.)Swingle(CMS)的葉片，經廣州中醫藥大學鑒定教研室張丹雁教授鑒定。樣品來源見表1。

1.2儀器與試劑Beckman-15CSR冷凍高速離心機；PCR儀(AppliedBiosystems2720Thermalcycler)；UVPGDS7600型凝膠成像儀；ECANSpectraFLUORplus多功能酶標儀。大連寶生物DR001AMPCR擴增試劑盒；上海生工隨機引物；上海生工進口分裝瓊脂糖；上海申能博彩3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒；天為時代DNAMarker(200bpDNALadderplus)；其他試劑均為國產分析純試劑。

表1樣品來源（略）

1.3方法

1.3.1佛手總DNA的提取和檢測采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取。將提取到的DNA用純水稀釋10倍后，用酶標儀分別測定其在260，280nm處的吸收值，計算出OD260與OD280的比值及DNA濃度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結果的優劣。

1.3.2佛手RAPD反應體系和擴增程序在對佛手PCR擴增體系優化后，確定反應的總體積為25μl，包括：MgCl22μl(25mmol/L)，引物1.5μl(10μmol/L)，dNTPs2μl（2mmol/L），10×buffer緩沖液3μl，0.3μlTaq酶（5U/μl），60ngDNA樣品。

PCR擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性1min,35℃退火lmin,72℃延伸1.5min，40次循環，最后72℃延伸10min，－20℃保存。

1.3.3引物篩選選取德慶、青衣童子兩種地理位置差異較大的DNA樣品做模板，用110個引物(S1～S100,S220～S229)對其進行PCR擴增篩選。

1.3.4擴增與產物檢測13個佛手DNA樣品作為擴增模板，用篩選的引物及條件進行RAPD反應，擴增產物經電泳、染色后在凝膠分子成像儀上檢測并拍照記錄。

1.3.5數據分析將電泳圖譜上清晰且可重復出現的條帶記為“1”，同一位置沒有出現條帶的記為“0”，從而生成由“1”和“0”組成RAPD表型數據矩陣。統計每條引物擴增出的總帶數和多態性帶數，計算多態性位點百分率p=(k/n)×100%（其中k是多態位點數目；n為所測位點總數）。利用NTSYSpc-2.10e求出Nei-Li相似系數矩陣，用UPGMA法對其進行聚類分析。

2結果

2.1引物篩選110個引物中有51條引物擴增出條帶，每條引物擴增帶數1～15條，平均6條，擴增的譜帶分子量大小在300～2200bp，16條引物擴增的多態性帶相對較多，且條帶清晰、重復性好。

2.2擴增產物的多態性分析以16個10mer引物對供試的13份材料進行PCR擴增，統計結果見表2。16個引物共擴增出185條帶，其中多態性帶有168條，占90.8%；平均每個引物可擴增出11.6條帶，平均每份材料可擴增出14.2條帶，擴增的譜帶分子量大小在300～2200bp；各個引物間擴增的位點數相差較大，不同引物的擴增帶數變幅從6～15條不等，其中擴增帶數最多的引物為S23，具15條擴增帶，最少的為引物S6，僅具6條擴增帶，說明不同引物與供試材料總基因組DNA部分區域的同源性具有較大的差異。部分引物的擴增結果見圖1。

表216個引物的擴增結果（略）

2.3聚類分析13份供試材料的Nei遺傳相似系數矩陣如表3所示，經聚類分析構建親緣關系樹狀圖（圖2）。相似系數分布在0.58～0.89之間，說明佛手種質的遺傳多樣性較為豐富。供試材料在相似系數為0.67處分為3個類群，第1類群包括Sn1，Sn2，Sn3和Sn4，第2類群包括Sn5，Sn6，Sn7和Sn8，第3類群包括Sn9，Sn10，Sn11，Sn12和Sn13。

表313份佛手種質資源的相似系數矩陣（略）

圖中對應的各個泳道的品種順序相同，從左到右依次為Sn1～Sn8，DNAMarker(200bpDNALadderplus)，Sn9～Sn13，陰性對照

圖1引物S24，S31，S80，S220的RAPD擴增圖譜（略）

3討論

本研究應用RAPD技術對佛手種間親緣關系進行了闡明，來源不同的13份種質的遺傳多樣性高達90.8%，表明佛手現有的種質遺傳變異較大，從而構成了較為豐富的種質資源基因庫，說明佛手遺傳基礎廣，具有較大的育種潛力和較強的進化能力，這與佛手栽培歷史悠久和種植范圍較廣有關。

圖2基于RAPD分析產生的佛手種質資源聚類圖（略）

供試材料在相似系數為0.67處分為3個類群，這與按照產地的不同將佛手分為廣佛手、浙佛手和川佛手的劃分一致。第1類群和第3類群中各種質之間的親緣較近，這與它們在植物學形態上差異不大的情況相吻合。第2類群中4個栽培品種雖然在植物學形態上差異較大，但由于生長環境相同，在相似系數0.75處聚為一類，親緣關系也較近，可能是遺傳基因和環境相互作用的結果；其中，Sn8為Sn5的芽變選育品種，兩者在形態上有較大的差異，但分子水平上證明其遺傳關系較近；Sn6和Sn7兩者在葉片、花、果等植物學形態上差異較大，但其相似系數為0.78，表明其親緣關系較近，形態上的差異并未在分子水平上反映。第3類群中，Sn9（瀘州開手果）與Sn10（瀘州拳手果）代表佛手的兩種不同果型，以前通常按果型將佛手分為兩種農家品種，但筆者在實地調查中發現，目前開手與拳手果型的分化不明顯，同一樹上經常會出現兩種果型，而且春果一般為開手型，夏果一般為拳手型，表明佛手在長期的自然演化中，果型已出現了混雜，果型的差異并不能說明其遺傳距離的遠近。