三維熒光光譜研究溶解性有機(jī)質(zhì)組織范文

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《Chinese Journal of Analytical Chemistry雜志》2016年第10期

摘要：

采用分子排阻色譜和激發(fā)/多波段發(fā)射熒光檢測器，結(jié)合三維熒光光譜和平行因子分析，研究了新、老填埋垃圾滲濾液中溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)的組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種滲濾液來源的DOM均含有類蛋白和類腐殖質(zhì)物質(zhì)。在新填埋垃圾滲濾液中，類蛋白物質(zhì)有4種存在形態(tài)，包括大分子蛋白質(zhì)形態(tài)、高/低分子量腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)和多肽/氨基酸形態(tài);在老填埋垃圾滲濾液DOM中，類蛋白物質(zhì)只有兩種形態(tài)，分別為大分子蛋白質(zhì)形態(tài)和腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)。相比于分子排阻色譜，三維熒光光譜結(jié)合平行因子分析能夠分辨出腐殖質(zhì)和非腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)的類蛋白物質(zhì)，但不能有效區(qū)分蛋白質(zhì)和以多肽/氨基酸形態(tài)存在的類蛋白物質(zhì)。結(jié)果表明，三維熒光光譜結(jié)合平行因子分析和分子排阻色譜，可以表征DOM中不同形態(tài)分布的類蛋白和類腐殖質(zhì)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：

溶解性有機(jī)質(zhì);熒光光譜;分子排阻色譜;平行因子分析

1引言

溶解性有機(jī)質(zhì)是環(huán)境中一類重要的物質(zhì)，能夠?yàn)槲⑸锾峁I養(yǎng)和能量、介導(dǎo)微生物與氧化性物質(zhì)之間的電子傳遞［1］、絡(luò)合重金屬［2］、以及吸附和增溶疏水性有毒有機(jī)物［3］，在陸地和水生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的功能，因此成為研究熱點(diǎn)。DOM成分復(fù)雜，包含有蛋白質(zhì)、多糖、氨基糖、核酸和腐殖質(zhì)等多種物質(zhì)，目前常用的分析方法包括紫外光譜［3］、熒光光譜［3，4］、紅外光譜［4，5］和核磁共振［5］。上述方法中，熒光光譜由于具有樣品預(yù)處理簡單、分析所需樣品量少、靈敏度高等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為研究DOM的最常用技術(shù)［6，7］。采用熒光光譜分析技術(shù)，可以將DOM分為不同類別的熒光組分［8］。然而，由于DOM是一大類組成和來源不同的混合物，其中許多物質(zhì)存在結(jié)構(gòu)相似的單元，不同物質(zhì)的熒光圖譜可能相互重疊，給采用熒光光譜精確分析DOM組成和結(jié)構(gòu)增加了困難［9，10］。為了降低DOM的異質(zhì)性，減少不同熒光組分的重疊，研究者采用了一些數(shù)學(xué)方法如平行因子分析法［9］、主成分分析法［10］、自組織人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法［11，12］和物理化學(xué)方法如色譜分離法［13］、樹脂分離法［14］，將DOM分成光譜圖和理化特性各異的組分單元［10，13］。在數(shù)學(xué)方法中，平行因子方法對DOM組分的分離效果最好、應(yīng)用最廣泛［9，10］，但平行因子分析涉及復(fù)雜的數(shù)學(xué)程序，且組分?jǐn)?shù)目的確定受到樣品數(shù)量的影響［10］。在物理化學(xué)分離法中，樹脂分離需要調(diào)節(jié)pH值，一定程度上改變了DOM組分的存在狀態(tài)，與天然實(shí)際環(huán)境中的DOM存在一定的差異;而色譜分離不需要調(diào)節(jié)pH值，能更好地反映DOM的實(shí)際分布情況和組分，但色譜分離所得組分?jǐn)?shù)目也受諸多條件如洗脫液、洗脫方法等的影響［15，16］。因此，將數(shù)學(xué)分析和色譜分離兩種方法結(jié)合，充分利用兩種分析方法各自的優(yōu)點(diǎn)，可以更有效和全面地揭示DOM的組成特征，目前尚缺乏這方面研究相關(guān)報(bào)道。基于此，本研究結(jié)合熒光光譜、分子排阻色譜和平行分子分析法，將DOM按不同的特性分組，探究其組成和結(jié)構(gòu)特性。本研究結(jié)果可為DOM表征和地球環(huán)境化學(xué)行為預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)。

2實(shí)驗(yàn)部分

2．1儀器與試劑

MultiN/C2100型總有機(jī)碳分析儀(TOC，德國耶拿公司);F-7000型熒光光譜儀(日本日立公司);1200LC高效液相色譜(美國安捷倫公司);L-530離心機(jī)(湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。HClO4、NaOH、Cu(NO3)2、Pb(NO3)2、CH3COONH4均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2．2樣品采集與預(yù)處理

為了獲得具有代表性的樣品，在某生活垃圾填埋場，采集填埋年限不到1年的新鮮垃圾產(chǎn)生的滲濾液樣品S1和和填埋年限大于10年的陳腐垃圾產(chǎn)生的滲濾液樣品S2，12000r/min離心10min后，收集上清液，過0．45μm濾膜，收集濾液，濾液中有機(jī)物即為DOM。采用總有機(jī)碳分析儀測定DOM樣品中溶解性有機(jī)碳(DOC)含量，備用。2．3DOM的物理分離將所得DOM樣品的DOC調(diào)至6mg/L后，測定樣品的熒光光譜:PTM電壓700V，激發(fā)和發(fā)射波長狹縫寬5nm，激發(fā)波長200～400nm，發(fā)射波長280～500nm，激發(fā)和發(fā)射波長增量5nm，掃描速度2400nm/min。分子排阻色譜采用配有熒光檢測器的1200LC系統(tǒng)進(jìn)行，所用分離柱和保護(hù)柱分別為PLaquage1-OH(50mm×7．5mm，8μm)和MIXED-M(300mm×7．5mm，8μm)(美國安捷倫公司)，洗脫液為pH=7的醋酸銨緩沖液，進(jìn)樣量100μL，洗脫速度1mL/min。檢測器為激發(fā)/多波段發(fā)射波長的熒光檢測器，激發(fā)波長230nm，發(fā)射波長300～500nm，發(fā)射波長增量為1nm。2．4DOM的數(shù)學(xué)分離DOM三維熒光光譜的平行因子分析需要多個(gè)樣品，為了獲得多個(gè)樣品，制備DOC為6mg/L的DOM樣品S1和S2各18份，采用熒光猝滅滴定方法，分別加入Cu(NO3)2或Pb(NO3)2溶液，使DOM樣品中Cu2+或Pb2+的濃度依次為10，20，30，40，50，60，70，80和90μmol/L，將樣品在恒溫振蕩器上振蕩4h后，測定其三維熒光光譜，測定條件與DOM未加重金屬時(shí)

2．3節(jié)中的條件相同

將上述光譜數(shù)據(jù)扣除超純水光譜后導(dǎo)出，進(jìn)行平行因子分析。平行因子分析方法如下:將樣品S1或S2的19種重金屬離子濃度為0～90μmol/L三維熒光光譜數(shù)據(jù)矩陣，在MATLAB2007上，采用的DOMFluortoolbox數(shù)據(jù)包(www．models．life．ku．dk)進(jìn)行分析。首先是將DOM三維熒光光譜圖去除一次瑞利散射和二次瑞利散射，隨后經(jīng)異常值檢驗(yàn)、對半分析、核一致性分析、累計(jì)方差和分析及視覺檢驗(yàn)［3，9，10］，確定樣品S1和S2可以各分離出4種不同的熒光組分，將所得組分在MATLAB上制圖。比較DOM經(jīng)分子排阻色譜和平行因子分析所得組分?jǐn)?shù)目和激發(fā)、發(fā)射波長，確定兩種分離方法所得組分的異同。

3結(jié)果與討論

3．1DOM的三維熒光光譜

圖1為DOM的三維熒光光譜，樣品S1在發(fā)射波長小于380nm的區(qū)域具有較高的熒光強(qiáng)度，而樣品S2在發(fā)射波長大于380nm的區(qū)域具有較高的熒光強(qiáng)度，綜合文獻(xiàn)［17～20］可知，發(fā)射波長小于380nm的區(qū)域?yàn)轭惖鞍孜镔|(zhì)，包括類色氨酸物質(zhì)(發(fā)射波長小于325nm)和類酪氨酸物質(zhì)(發(fā)射波長大于325nm)。一些與類色氨酸結(jié)構(gòu)類似的多酚化合物，也在發(fā)射波長小于380nm范圍內(nèi)產(chǎn)生熒光峰［21］，這些物質(zhì)與類蛋白物質(zhì)具有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即均含有一個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)。三維熒光光譜中發(fā)射波長大于380nm的為類腐殖質(zhì)物質(zhì)，這些物質(zhì)含有兩個(gè)及以上的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在類腐殖質(zhì)物質(zhì)中，一些帶有3個(gè)和4個(gè)苯環(huán)的物質(zhì)，發(fā)射波長可能相同［22］。因此，可以推測，樣品S1主要為類蛋白物質(zhì)，而樣品S2以類腐殖質(zhì)物質(zhì)為主，兩個(gè)樣品代表了兩類不同的DOM組成。在DOM中，不同熒光組分的熒光圖譜可能相互重疊［10，23］;此外，類蛋白物質(zhì)可以以3種形態(tài)存在，包括多肽/氨基酸形態(tài)、腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)和大分子蛋白質(zhì)形態(tài)［8］，但圖1不能給出上述信息，需要采用物理和數(shù)學(xué)法對DOM熒光組分進(jìn)行分離。

3．2DOM組分的物理法分離

分子排阻色譜主要是基于分子量大小不同將DOM分組，在分子排阻色譜中，大分子有機(jī)物先被洗脫出來，而出峰時(shí)間晚的為小分子有機(jī)物［15，16］，通過洗脫時(shí)間可以將DOM按分子量大小分為不同的組分。由于DOM是一大類有機(jī)分子的混合體，不同分子之間可以通過疏水作用、氫鍵和范德華力結(jié)合在一起成為大分子復(fù)合物，因此本研究中的大分子應(yīng)為不同小分子通過一定作用力結(jié)合在一起的聚集體。在圖1中，由于激發(fā)波長230nm，發(fā)射波長300～500nm處的組分熒光強(qiáng)度較高，并且能代表所有的熒光物質(zhì)，因此，在分子排阻色譜中，固定熒光檢測器的激發(fā)波長為230nm、發(fā)射波長為300～500nm、增量為1nm進(jìn)行洗脫物熒光發(fā)射光譜測定。圖2a顯示出樣品S1含有4類物質(zhì)，其出峰時(shí)間依次約為3．45，3．9，4．45和4．65min，以4．45min出峰處物質(zhì)的熒光強(qiáng)度最高，顯示樣品S1含有4類分子量大小不同的物質(zhì)，其濃度最高的為小分子有機(jī)物。從圖2a還可見，3．45和4．65min主要出現(xiàn)發(fā)射波長小于380nm的熒光峰，而3．9和4．45min在300～500nm范圍內(nèi)均都出現(xiàn)了熒光峰，顯示3．45和4．65min處的組分主要為大分子蛋白質(zhì)和小分子多肽/氨基酸形態(tài)存在的類蛋白物質(zhì)，而3．90和4．45min處的組分主要為與腐殖質(zhì)結(jié)合在一起的類蛋白物質(zhì)［8］，并且其分子量小于蛋白質(zhì)分子但大于氨基酸/多肽物質(zhì)。樣品S2(圖2b)在3．30和3．85min處出現(xiàn)了兩個(gè)熒光峰，最大峰強(qiáng)出現(xiàn)在3．85min，出峰范圍為300～500nm，顯示其為類腐殖質(zhì)物質(zhì)。此外，在整個(gè)分離過程中，樣品S1和S2均在發(fā)射波長325～375nm范圍內(nèi)均出現(xiàn)了較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，其究竟是由類蛋白物質(zhì)引起，還是噪聲引起，還需要進(jìn)一步鑒定。本研究采用色譜柱分離法與樹脂分離類似，它們均能降低混合物的異質(zhì)性，He等［14］采用XAD-8大孔吸附樹脂將DOM分類出了不同親疏水組分，但是這種分離方法基于pH值調(diào)整到酸性范圍后DOM分子上極性官能團(tuán)的差異，而本研究采用色譜分離，是基于分析物分子量大小的差異進(jìn)行分離。

3．3DOM的數(shù)學(xué)法分離

圖3為樣品S1經(jīng)平行因子分析所得的4個(gè)組分。組分1有兩個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長為230nm，發(fā)射波長為280/340nm;組分2也有兩個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長分別為230和280nm，發(fā)射波長位于325～340nm范圍內(nèi)，以上兩個(gè)組分在發(fā)射波長大于380nm范圍內(nèi)也存在較強(qiáng)的熒光發(fā)射。由文獻(xiàn)［8］可知，組分1和2為腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)存在的類蛋白物質(zhì);組分3有一個(gè)尖峰和一個(gè)肩峰，其激發(fā)波長分別為230和250nm，發(fā)射波長均為300nm，屬于類色氨酸物質(zhì);組分4有3個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長分別為220，250和315nm，發(fā)射波長均為425nm，屬于類腐殖質(zhì)物質(zhì)［7］。組分1和2對應(yīng)于樣品S1分子排阻色譜中3．90和4．45min出峰的物質(zhì)，均為腐殖質(zhì)結(jié)合態(tài)存在的類蛋白物質(zhì)［8］;組分3對應(yīng)于樣品S1分子排阻色譜中3．45和4．65min出現(xiàn)的類蛋白物質(zhì)［17］，但組分4在分子排阻色譜中沒有對應(yīng)的物質(zhì)，其是否為實(shí)際組分還不得而知。如圖4所示，樣品S2經(jīng)平行因子分析得到4個(gè)組分，其中組分1有兩個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長分別為240和320nm，發(fā)射波長為410nm，參照文獻(xiàn)［8］，組分1為類腐殖質(zhì)物質(zhì);組分2也有兩個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長分別為235和280nm，發(fā)射波長在335～375nm范圍內(nèi)，為類蛋白物質(zhì)［17］;組分3含有3個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長分別為225、280和360nm，發(fā)射波長為440nm，為類腐殖質(zhì)物質(zhì)［17］;組分4含有兩個(gè)熒光峰，其激發(fā)波長均為225nm，而發(fā)射波長不同，此類物質(zhì)尚未見到相關(guān)報(bào)道。與樣品S2的分子排阻色譜相比，組分1對應(yīng)于分子排阻色譜中的3．85min的類腐殖質(zhì)物質(zhì)，組分2和3在樣品S2的分子排阻色譜中并未見對應(yīng)的物質(zhì)，組分4在樣品S2的色譜圖中一直存在，顯示分子排阻色譜中發(fā)射波長325～375nm范圍內(nèi)均出現(xiàn)的熒光強(qiáng)度對應(yīng)于某種物質(zhì)，可能為3．3min出現(xiàn)的類蛋白物質(zhì)。對比DOM經(jīng)分子排阻色譜和平行因子分析所得的組分發(fā)現(xiàn)，二者既有相同之處，有互相對應(yīng)的物質(zhì)，又有不同之處，顯示物理分離和數(shù)學(xué)分離各有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。由于不同有機(jī)分子之間可能通過疏水作用、氫鍵和范德華力結(jié)合在一起［15，24］，因此，分子排阻色譜并不能將所有分子分開;相比較而言，平行因子分析可以將這些組分分開而不受到上述作用力的影響。但是很多情況下，平行因子分析并不能有效揭示兩種物質(zhì)之間是共存關(guān)系還是單獨(dú)存在;此外，平行因子分析不能區(qū)分以大分子蛋白質(zhì)形態(tài)存在和小分子多肽/氨基酸形態(tài)存在的兩種類蛋白物質(zhì)，因此，將分子排阻色譜和平行因子分析聯(lián)用可以更加全面表征DOM組成情況，減少其復(fù)雜性和異質(zhì)性。

4結(jié)論

分子排阻色譜能有效分析DOM中不同物質(zhì)的分子量及其形態(tài)，可以將DOM分為小分子多肽/氨基酸、中等分子的腐殖質(zhì)以及大分子蛋白質(zhì);平行因子分析可鑒別分子排阻色譜中未分開的組分，并且能給出不同組分激發(fā)/發(fā)射波長的詳細(xì)信息，但平行因子分析不能分開蛋白質(zhì)和氨基酸/多肽形態(tài)的類蛋白物質(zhì)。結(jié)果表明，熒光光譜結(jié)合平行因子分析和分子排阻色譜，能有效、全面地表征DOM的組成。

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作者:鞏學(xué)勇 張宏志 侯超 王玉民 董建 單位:泰山醫(yī)學(xué)院 化工學(xué)院