大鼠多器官功能障礙模型建立研究范文

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《福建醫藥雜志》2016年第5期

摘要：

目的對大鼠多器官功能障礙綜合征（MODS）模型建立的方法進行探討。方法將75只大鼠隨機分為4組（正常組15只，大腸桿菌法模型組20只，內毒素試劑法模型組20只，酵母多糖法模型組20只），鉗斷模型組大鼠左下肢，4h后無菌條件下分別于腹腔注射大腸桿菌、內毒素、酵母多糖，比較各組大鼠造模成功率，記錄各模型組所需費用和造模難易度。結果各模型組造模成功大鼠符合MODS實驗診斷標準。大腸桿菌組成功率明顯高于酵母多糖組（90．0％vs35．0％，P＜0．05），與內毒素組比較的差異無統計學意義（90．0％vs60．0％，P＞0．05），大腸桿菌法、內毒素試劑法、酵母多糖法造模總費用分別為40．0、123．3、325．7元。酵母多糖造模過程復雜。結論鉗斷大鼠左下肢聯合腹腔注射大腸桿菌造模成功率高、成本低，值得推廣。

關鍵詞：

大鼠；多器官功能障礙綜合征；建模方法

建立多器官功能障礙綜合征（MODS）動物模型是研究MODS臨床診治的基礎，國內外學者致力于建立標準化的符合臨床要求的MODS動物模型。目前，大鼠MODS造模多采用創傷加內毒素或酵母多糖注射的方式，有造模成功率低、存活時間短、費用高昂、造模復雜等缺點［1］。本文對大鼠MODS模型建立的方法進行改良，旨在建立操作簡單、成本低、成功率高，符合MODS實驗診斷標準的模型。

1材料與方法

1．1材料：1）動物：成年清潔級SD雄性大鼠75只，體質量180～220g，由福建省醫學科學研究所動物室提供，生產許可證號SCXK（滬）2013－0006。大鼠使用動物室提供的標準鼠糧和自來水喂養，實驗立項經我院實驗動物倫理委員會批準。2）試劑：大腸桿菌菌株（E．coli0127：H6）由福建醫科大學惠贈。內毒素（4mg／支，Sigma公司）及酵母多糖（1g／支，Sigma公司）。

1．2動物分組及造模：1）分組：應用計算機將大鼠隨機分為4組，對照組（n＝15），大腸桿菌法模型組（n＝20），內毒素試劑法模型組（n＝20），酵母多糖法模型組（n＝20）。2）造模方法：同時鉗斷各模型組大鼠左下肢，4h后各模型組大鼠分別于腹腔注射大腸桿菌菌液、內毒素、酵母多糖，造成感染復合創傷2次打擊的MODS大鼠模型。大鼠處死前12h禁食，其他時間均標準喂養。①大腸桿菌法模型組：用分光光度法制備細菌濃度為1×109cfu／mL大腸桿菌菌液體待用，同時鉗斷大鼠左下肢，使大鼠發生粉碎性骨折合并軟組織挫裂傷，4h后在無菌條件下按5mL／kg腹腔注射大腸桿菌菌液。②內毒素組：同時鉗斷大鼠左下肢，4h后將內毒素（1．25mg／kg）稀釋后注射［2］，方式同上。③酵母多糖組：同時鉗斷大鼠左下肢，4h后將酵母多糖0．375g／kg配置成蠟塊融化狀液體后注射［3］，方式同上。

1．3觀察指標：

1．3．1實驗室指標：大鼠2次打擊后48h進行空腹采血，測定各組大鼠Cr、BUN、ALT、AST、PLT等指標。空腹采血后處死大鼠，留取肺肝等標本，經福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋切片、蘇木精染色、伊紅染色、樹膠封片，光學顯微鏡觀察各組大鼠各臟器病理形態。

1．3．2造模成功標準：依據MODS實驗診斷標準，根據MODS臨床定義，規定動物致傷24h后出現2個或2個以上功能障礙（或衰竭）者方可診斷MODS。受累器官待查項目中肝功能指標中ALT等≥對照值3倍，腎功能中血Cr等≥對照值3倍，凝血功能中PLT等≤50×109／L，確定模型組大鼠各臟器功能衰竭，支持MODS造模成功［4］。

1．3．3其他指標：記錄各組大鼠造模成功率、成活情況及各模型組建立所需費用、造模程序。

1．4統計學分析：應用SPSS19．0統計學軟件分析數據。計量資料以x±s表示、采用t檢驗；計數資料用百分比表示，采用χ2檢驗，且行Bonferroni較正。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1實驗室指標：各組造模成功大鼠的Cr、BUN、ALT、AST、PLT水平改變是對照組的3倍以上（表1）。

2．2病理形態：隨機抽取造模成功的模型組大鼠肺和肝臟，光鏡下見：部分肺泡隔斷裂，肺泡腔消失；氣管上皮纖毛脫落，上皮下水腫；肺泡上皮細胞增生，肺間質充血、水腫；血管擴張、充血；終末支氣管周圍、血管周圍和肺泡間隔有大量急慢性炎癥細胞浸潤（圖1）；肝細胞濁腫，匯管區見慢性炎癥細胞和纖維組織增生，中央靜脈周圍見少量慢性炎癥細胞浸潤（圖2）。根據上述實驗室指標和病理形態的改變，模型組大鼠發生了2個以上的臟器功能障礙及形態損傷，符合胡森等［4］提出的MODS實驗診斷標準。

2．3各組大鼠造模成功率及死亡率：大腸桿菌法組造模成功18例（90．0％），死亡1例，1例未見多臟器功能衰竭；內毒素組造模成功12例（60．0％），死亡6例，2例未見多臟器功能衰竭；酵母多糖組造模成功7例（35．0％），死亡3例，10例未見多臟器功能衰竭。大腸桿菌組與內毒素組造模成功率無顯著變化（P＞0．05），兩組成功率均高于酵母多糖組（P＜0．05）。

2．4各組造模費用及難易度：1）大腸桿菌法造模操作簡單，每只平均費用為40．0元；2）內毒素法造模操作簡單，每只平均費用為123．3元；3）酵母多糖法造模成本較高如試劑較貴，每只平均費用為325．7元，操作較困難如酵母多糖配制后呈密度極大的渾濁融化蠟塊狀液體，注入大鼠腹腔困難。

3討論

MODS是機體在損傷或感染情況下，引發免疫、炎癥反應啟動、放大，促炎和抗炎互為因果，形成具有破壞力的免疫狀態，進而出現瀑布式的級聯反應導致器官損傷。研究MODS的替代模型需具備疾病相同的臨床情況。目前，國內外學者都試圖建立一種與臨床MODS常見誘因基本一致，發病在致傷24h后，有2個以上器官或系統的功能障礙，有足夠的發病率和死亡率且價格低廉、制作過程簡便的模型［4］。造模方式及存在主要問題如下：1）若動物存活率高、則MODS發生率低；若創傷休克嚴重，則動物死亡率高。2）成本較高如內毒素等制劑價格昂貴，手術操作難度大。此外，若以外科手段造模，如采用腸系膜上動脈阻斷方法復制腸缺血再灌注等方式，操作難度大，MODS發生率低或動物死亡率高［1］。采用鉗斷模型組大鼠左下肢先造成無菌創傷出血，激活機體免疫反應；4h后在無菌條件下給大鼠腹腔注射大腸桿菌菌液替代內毒素，當機體被大腸桿菌感染后，免疫系統啟動特異性識別機制進行防御，侵入的部分細菌死亡、溶解釋放內毒素，大腸桿菌內毒素作用于腸黏膜上皮細胞，引起一系列細胞因子釋放，破壞機體的防御機制，導致局部大腸桿菌繁殖，感染進展［5］，成為第2次打擊的觸發因子，大鼠表現出強烈的全身炎癥反應的臨床特征，從而造成創傷復合感染2次打擊的MODS大鼠模型。對此，從功能指標和組織細胞形態學指標兩個方面判斷造模是成功的，符合MODS實驗診斷標準［4］。此外，對3個模型組的成功率、實驗成本、造模難易度進行比較，也證實了大腸桿菌法造模的成功率高，成本低且操作簡單。經復習國內外文獻，鮮見有類似的報道。總之，大腸桿菌法造模的成功率高，成本低且操作簡單，有助于從事MODS研究者們開展實驗研究。鉗斷大鼠左下肢聯合腹腔注射大腸桿菌的方法值得推廣。

參考文獻：

［1］譚清武，李慶華．多器官功能不全綜合征動物模型研究現狀［J］．中國康復理論與實踐，2006，12（11）：981－982.

［4］胡森，盛志勇，周寶桐．MODS動物模型研究進展［J］．中國危重病急救醫學，1999，11（8）：504－507．

［5］張玉昆，唐英春，覃德冰．內毒素在大腸桿菌和白色念珠菌混合感染小鼠中的作用［J］．中山醫科大學學報，2002，23（3）：200－203．

作者:魏碩 游哲斌 林春錦 何玲玲 郭太林 林帆 江淑萍 戴木森 單位:福建醫科大學省立臨床醫學院福建省立醫院干部特診一科