柴胡生物技術與皂苷合成生物學研究范文

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[摘要]合成生物學是解析中藥活性成分生物合成途徑、發(fā)掘參與生物合成功能基因的一門新興學科。柴胡是我國常用大宗中藥材，藥用價值顯著。柴胡皂苷是其指標性成分，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等顯著活性。但目前野生柴胡資源遭到破壞，人工栽培過程中存在一定問題。生物培養(yǎng)技術及合成生物學的應用可擴大柴胡皂苷的來源，保護柴胡資源。不同植物的培養(yǎng)條件沒有固定模式可遵循，不同藥用活性成分的生物合成途徑也是不一致的。目前，尚無柴胡組織培養(yǎng)技術及柴胡皂苷生物合成途徑研究的綜述報道。本文擬介紹合成生物學過程中用到的愈傷組織培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)與懸浮細胞培養(yǎng)等生物培養(yǎng)技術與柴胡皂苷生物合成途徑及其關鍵酶功能基因的研究進展，建議通過借鑒其他傳統(tǒng)根類藥材的組織培養(yǎng)技術，對柴胡的生物培養(yǎng)技術進行優(yōu)化，為深入研究柴胡皂苷的生物合成途徑與代謝調控提供參考。

[關鍵詞]柴胡；生物培養(yǎng)技術；柴胡皂苷；合成生物學；不定根；培養(yǎng)條件；組學

合成生物學是利用基因組測序技術、計算機模擬技術、生物工程技術和化學合成技術等設計生物工廠進而產生高價值化合物的學科。許多藥用植物生長受環(huán)境影響較大且生長周期長，藥用活性成分在原植物中含量低[1]。將合成生物學靈活應用到現(xiàn)代中藥中，用于研究中藥藥用活性成分，是獲得部分中藥有效成分的重要方法之一，從而使中藥資源得到有效保護與可持續(xù)利用。現(xiàn)已有多種中藥藥用活性成分進行合成生物學研究，例如丹參酮[2]、青蒿素[3]、紫杉醇[4]、柴胡皂苷[5]等。柴胡是我國常用大宗中藥材，藥用歷史悠久，始載于《神農本草經(jīng)》，列為上品，具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、保肝等功效，是傳統(tǒng)中醫(yī)治療少陽證的首選藥物。柴胡藥用價值顯著，是柴胡疏肝丸、小柴胡顆粒、逍遙丸、感冒清熱顆粒等中成藥的主要成分。其市場需求量逐步增大，野生柴胡資源遭到開采，蘊藏量逐漸下降。此外，野生柴胡資源存在來源地不明、種質混雜等弊端，藥材均一性差、藥材市場混亂導致藥效不穩(wěn)定。目前應用的柴胡多為人工栽培品，發(fā)芽率低、出苗不整齊、周期長、產量低；且在栽培中通常使用農藥，易造成農藥殘留和重金屬殘留等問題。為了保護日漸枯竭的野生柴胡資源，保證藥材質量和藥效，應用現(xiàn)代生物技術，特別是組織培養(yǎng)技術，進行大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，對解決這些問題具有重要意義[6]。合成生物學的飛速發(fā)展，也可進一步擴大柴胡皂苷的來源，進而保護柴胡資源；其借助于人工設計或改造的微生物細胞工廠合成自然界中不易得到的天然產物，對于獲取成本較高的中藥活性成分的工業(yè)化生產具有重要意義。應用組織培養(yǎng)技術、生物合成技術皆可有效應對當今柴胡資源出現(xiàn)的問題。在不同植物中應用的生物培養(yǎng)技術是類似的，但不同植物的培養(yǎng)條件沒有固定模式可遵循。不同藥用植物中的藥用活性成分不同，在不同植物體內的生物合成途徑也是不一致的。目前，尚無柴胡組織培養(yǎng)技術及柴胡皂苷生物合成途徑研究的綜述報道，本文通過介紹合成生物學過程中用到的愈傷組織培養(yǎng)、不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)與懸浮細胞培養(yǎng)等生物培養(yǎng)技術，柴胡皂苷生物合成途徑及其關鍵酶功能基因的研究進展，對柴胡的生物培養(yǎng)技術提出可能的優(yōu)化方案，為深入研究柴胡皂苷的生物合成途徑與代謝調控提供參考。

1柴胡的生物培養(yǎng)技術研究進展

我國有柴胡屬植物36種，柴胡藥材來源廣泛，各地使用品種不一。據(jù)調查，中國現(xiàn)在使用的柴胡主要有25種之多，廣泛分布于除海南省以外的全國各省[7]。然而2015年版《中國藥典》（一部）收載的柴胡來源僅為柴胡Bupleurumchinese或狹葉柴胡B.scorzonerifolium，分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”。柴胡為傳統(tǒng)的根類藥材，可以采用不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)等技術獲取柴胡中柴胡皂苷等藥用活性成分。在生物培養(yǎng)過程中，可通過調節(jié)培養(yǎng)基成分、添加適宜濃度的外源物質、激素等促進生長、提高產量及其藥用活性成分的含量。

1.1愈傷組織培養(yǎng)技術植物愈傷組織是薄壁松散的細胞團。愈傷組織培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)中的基礎技術，操作步驟相對簡單，且有重要的應用價值。愈傷組織培養(yǎng)技術指在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞、胚胎、原生質體培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基中，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產生愈傷組織[8]。研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織在適宜的培養(yǎng)條件下，可產生比原外植體更多的次生代謝產物[9]。柴胡愈傷組織的常見培養(yǎng)方法是取柴胡無菌苗的不同部位，在添加了適宜濃度植物激素的培養(yǎng)基中進行誘導，即脫分化的過程。姚智等[10]發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基中添加4mg•L-1萘乙酸（NAA）及0.2mg•L-1激動素（KT）是最適宜無菌苗誘導產生愈傷組織的條件。愈傷組織在培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)褐化問題，研究表明采用N6培養(yǎng)基并在其中加入3.0mg•L-12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.5mg•L-16-芐氨基腺嘌呤（6-BA）及1.5g•L-1抗褐化劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可減少培養(yǎng)過程中褐化問題，同時提高愈傷組織的誘導率[11]。愈傷組織不僅可以進一步再分化，誘導產生不定根、毛狀根等，同時也是制備原生質體的理想材料。原生質體是去除堅韌細胞壁后裸露的植物細胞，在快速繁殖、遠緣遺傳重組、選育優(yōu)良突變體方面有重要作用。應用柴胡的原生質體分別與胡蘿卜[12]、葡萄、石防風及川西獐牙菜[13]等原生質體雜交已見報導。程玉鵬等[14]使用2%纖維素酶+1%離析酶酶解細胞壁，采用0.6mg•L-1甘露醇為穩(wěn)滲劑，27℃避光預裂解2h后酶解4h時可獲得較多的狹葉柴胡原生質體，為進一步研究提供了材料。

1.2不定根培養(yǎng)技術不定根是指從植物的非根組織上形成的根，如從莖葉等位置上長出的根。不定根的發(fā)生方式分為2種，一種為直接生發(fā)，即從莖，葉，枝條上直接生長出不定根；另一種為間接生發(fā)，即先產生愈傷組織，再進行分生、分化，最后產生不定根原基。不定根培養(yǎng)的增殖速度快，獲取量多[15]。楊東方等[16]通過直接生發(fā)實驗，在MS或1/2MS培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的吲哚丁酸（IBA）進行北柴胡的帶側芽莖段不定根誘導，不定根誘導成功率在80%以上，效果顯著。在間接生發(fā)實驗中，培養(yǎng)基中通常可加入各種植物激素、前體物質、誘導子、抑制劑等誘導愈傷組織，可以提高柴胡不定根中有效成分含量[15]。實驗發(fā)現(xiàn)NAA更適于誘導愈傷組織產生不定根，并且宜在黑暗條件下誘導產生愈傷組織和不定根[10]。若選擇叢生芽誘導不定根的方法，余馬等[17]選擇北柴胡帶葉嫩莖段為外植體，在基本培養(yǎng)基中加入1.0mg•L-16-BA誘導產生的不定芽數(shù)量多、鮮重及干重高、葉綠素含量高。剝離叢生芽放入0.1mg•L-1NAA的基本培養(yǎng)基中，誘導產生的不定根個數(shù)多、葉綠素含量高。在不定根誘導產生次生代謝物柴胡皂苷實驗中，關倩[15]發(fā)現(xiàn)在基礎培養(yǎng)基中添加不同濃度前體物質、誘導子均可不同程度的提高北柴胡中柴胡皂苷含量。采用分步控糖法，控制蔗糖質量分數(shù)為5%時適宜北柴胡不定根生長和皂苷合成。通過補加培養(yǎng)基的方法也可延長不定根生長及柴胡皂苷合成的時間。王梅等[18]以3種產于山西萬榮、左權、芮城的柴胡為原植物體，在基礎培養(yǎng)基中添加乙酸鈉、水楊酸（SA）和Cu2+，均有利于不定根合成柴胡皂苷。戰(zhàn)晴晴等[19]利用茉莉酸甲酯處理北柴胡不定根，發(fā)現(xiàn)其對柴胡皂苷的積累有明顯促進作用。Hilo等[20]研究指出，鐵元素及銨根離子（NH4+）可以加速不定根的生成，進而提高次生代謝物的合成速率。目前，關于柴胡不定根培養(yǎng)技術的研究相對較多[10,15-20]，培養(yǎng)條件日益成熟。選擇不同的生物反應器、嘗試添加不同的誘導子，不定根的生長速率及其柴胡皂苷的含量可能會進一步提高。

1.3毛狀根培養(yǎng)技術毛狀根培養(yǎng)于1980年展起來，是將基因工程與細胞工程相結合的一項生物技術，1977年首次用發(fā)根農桿菌侵染高等植物獲得毛狀根，通過將發(fā)根農桿菌中Ri質粒的轉移DNA（T-DNA）整合到植物細胞的DNA上，誘導植物細胞產生毛狀根。毛狀根具有生長迅速、生長條件簡單、次生代謝物合成產量高且穩(wěn)定、不需外源激素、在無激素培養(yǎng)基上也能快速生長等優(yōu)點。例如可培養(yǎng)罌粟毛狀根來獲得芐基異喹啉類生物堿，以此減少罌粟的種植，且安全有效[21]。影響毛狀根生長及有效成分積累的因素很多，如物理因素、化學因素、誘導子等[22]。物理因素常見的有光照、溫度、水、溶氧情況和pH等，化學因素常見的有培養(yǎng)基類型、外源激素、前體物質[23]等，誘導子可分為生物誘導子（如細菌、真菌）和非生物誘導子[如茉莉酸甲酯（MeJA），SA及重金屬等]。孫晶等[24]研究指出在添加0.5mg•L-1IBA的B5培養(yǎng)基中，毛狀根和柴胡皂苷產量最高，分別為2.4g和9.05mg。YANG等[25]研究顯示，酵母抽提物（YE）和Ag+可提高丹參毛狀根中次生代謝物含量，因此可嘗試在柴胡毛狀根培養(yǎng)基中加入不同的誘導子來提高柴胡皂苷的含量。柴胡毛狀根培養(yǎng)方面所做的研究較少，特別是南柴胡毛狀根的培養(yǎng)，這可以作為下一步的重點研究方向。

1.4懸浮細胞培養(yǎng)技術植物懸浮細胞培養(yǎng)技術是將植物愈傷組織加入裝有特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，并在搖床中振蕩培養(yǎng)，來得到植物代謝產物。影響柴胡懸浮細胞生長速率的因素有愈傷組織接種量、培養(yǎng)基體積和外源物質種類及其濃度等。在懸浮細胞培養(yǎng)過程中，其生長分裂需具有一定的初始細胞密度，但細胞密度過高則細胞液泡膨脹，容易積累有害物質進而影響次生代謝物的合成。程玉鵬等[26]驗證狹葉柴胡懸浮細胞的最佳生長條件是無菌條件下取狹葉柴胡愈傷組織2.0g，將其放入裝有MS發(fā)酵液100mL的250mL錐形瓶中，細胞鮮重增加2.342g。周永強[27]分析狹葉柴胡懸浮細胞干重隨時間變化的曲線，得知在第15天時，細胞干重最大，若在培養(yǎng)基內添加250mg•L-1水解酪蛋白可得細胞最佳收獲量。另外，也可嘗試添加不同的外源物質如Mg2+等來提高細胞收獲量。懸浮細胞培養(yǎng)技術步驟簡單，但相關實驗開展不多，可進一步優(yōu)化其培養(yǎng)條件，得到穩(wěn)定的培養(yǎng)體系。

2柴胡皂苷合成生物學研究進展

合成生物學的研究包括解析化合物的生物合成途徑，明確其中關鍵酶基因功能，進而構建人工系統(tǒng)，優(yōu)化培養(yǎng)方案，實現(xiàn)大規(guī)模生產。目前柴胡皂苷詳細的生物合成途徑尚不完全明晰，但合成途徑上游中間體及相關酶基因已經(jīng)有所報道，下游細胞色素P450酶基因與糖基轉移酶（UGT）基因還未研究透徹。

2.1柴胡皂苷的生物合成途徑根據(jù)現(xiàn)有研究推測柴胡皂苷合成主要包括3個階段，分別為前體形成、三萜骨架的搭建、結構修飾。柴胡皂苷的生物合成途徑見圖1。

2.2柴胡皂苷合成途徑中關鍵酶功能基因研究2.2.13-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因由乙酰輔酶A（乙酰CoA）形成3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A（HMG-CoA），然后在其還原酶HMGR的催化作用下生成甲羥戊酸（MVA）。生成的MVA是類異戊二烯生物合成途徑中的重要前體，HMGR基因是此途徑中的第1個限速酶[28]，此過程是不可逆反應。董樂萌等[5]采用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）從北柴胡植株中克隆了HMGR基因互補脫氧核糖核酸（cDNA）片段，并對獲得的序列進行初步分析，通過DNAMAN軟件，在HMGR氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了2個功能煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）結合基序，分別為DAMGMNM和GTVGGGT。2.2.2異戊烯基焦磷酸異構酶（IPPI）基因柴胡皂苷屬于類異戊二烯化合物，是由異戊烯基焦磷酸（IPP）與其烯丙基異構體二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）縮合后經(jīng)一系列催化反應而形成[29]。其中IPP和DMAPP的相互轉化由IPPI催化。IPPI是類異戊二烯化合物生物合成過程中的關鍵酶[30]，大多數(shù)植物體細胞內存在2種不同亞細胞定位的IPPI[31-32]。董樂萌等[5]報道了北柴胡柴胡皂苷合成途徑中關健酶基因IPPI的cDN段，獲得了新的基因片段序列，并通過構建植物IPPI的分子進化樹表明，北柴胡IPPI基因與傘形科植物（胡蘿卜和三島柴胡）親緣關系最近。隋春等[33]利用PCR矩陣法快速篩選出北柴胡全長cDNA文庫，并首次克隆出生物合成途徑中關鍵酶之一的IPPI的全長cDNA，此基因核苷酸序列長1117bp，編碼了319個氨基酸。2.2.3鯊烯合酶鯊烯合酶（SS或SQS）是植物甾醇和三萜化合物生物合成的關鍵酶，其定位于細胞內質網(wǎng)膜，催化兩分子的法呢酰基二磷酸（FPP）縮合生成植物甾醇和三萜類化合物形成的第一個前體——鯊烯。隋春等[34]等根據(jù)氨基酸序列的同源性構建了32種植物中43條蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明不同植物來源的氨基酸序列長度差別不大，同一種植物的2條氨基酸序列差異也不大，由此得出氨基酸在進化過程中相對保守。以北柴胡不定根為材料，運用Trizol法提取總RNA，從北柴胡中擴增出鯊烯合酶cDNA特異性片段，并進行了克隆與測序。測序結果顯示得到了2個序列不同的cDNA（BcSS1和BcSS2），序列長度分別為1245bp和1248bp，分別編碼了414，415個氨基酸。2.2.4β-香樹脂醇合成酶（β-AS）β-AS是合成各類三萜類產物的前體，由于大多數(shù)三萜類皂苷是由齊墩果烷和達瑪烯衍化而來的，因此β-AS對三萜類皂苷的合成有舉足輕重的作用。董樂萌[35]利用RT-PCR從北柴胡中擴增出了β-AS，并發(fā)現(xiàn)β-AS基因在根中的含量最高，是葉子中含量的11.5倍。2.2.5細胞色素P450酶植物細胞色素P450酶具有廣泛的催化活性，參與了苯丙烷類、植物激素、生氰糖苷類、萜類、生物堿等化合物的生物合成，被稱為“萬能生物催化劑”。其催化作用的共同特點是在前體分子中加入1個氧原子。在三萜皂苷的生物合成中，細胞色素P450酶主要催化三萜骨架惰性甲基和亞甲基的氧化。但細胞色素P450酶催化反應很復雜，對其的研究為數(shù)不多。徐潔森[36]利用454高通量測序獲得5'和3'端部分cDNA序列基礎上，利用長距離-PCR（LD-PCR）獲得全長cDNA，擴增到了北柴胡細胞色素P450酶基因BcCYP87E并構建了這一基因的過量表達載體，但該基因功能尚未驗證。2.2.6UGTUGT位于三萜皂苷生物合成途徑下游，其可催化三萜骨架糖基化。UGT在生物體內將糖基催化活化并連接到不同的受體分子如蛋白、核酸、寡糖等。糖基化的產物具有很多生物學功能，現(xiàn)普遍認為代謝物和外源物的糖基化可調整其穩(wěn)定性、生物活性、溶解度以及信號存儲或者內部運輸、胞間運輸?shù)萚37-38]。在植物體的調控和代謝途徑中UGT通過對一系列化合物的激活、抑制或者是溶解度調節(jié)而發(fā)揮作用。三萜皂苷的苷元糖基化是決定三萜皂苷生物活性的重要一步。三萜皂苷的糖基通常是由寡聚糖鏈和2~5個單糖單元構成，糖鏈和單糖較多連接在皂苷元的C-3或C-28位置。徐潔森[36]在454高通量測序已獲得部分cDNA序列基礎上，通過cDNA末端快速擴增技術（RACE）和LD-PCR擴增全長cDNA克隆。得到北柴胡其中1個UGT基因，并命名為BcUGT10。構建了這一基因的過表達和抑制表達轉基因載體，但北柴胡中還有部分UGT基因尚未發(fā)掘。

3展望

生物培養(yǎng)技術與合成生物學的結合日益密切，二者之間相輔相成。例如在研究基因功能的實驗中所用的基因沉默、過表達技術[39]，可用轉入特定載體的發(fā)根農桿菌侵染外植體的方法獲得毛狀根來進行深入研究。此外也可在原生質體、毛狀根中[40]轉入外源如綠色熒光蛋白等蛋白質基因，以進一步研究基因功能。今后，生物培養(yǎng)技術勢必將更廣泛地運用于合成生物學中，加速柴胡皂苷生物合成途徑的解析過程。在生物培養(yǎng)技術應用過程中，培養(yǎng)條件將逐漸被優(yōu)化，方法也會更加成熟。毛狀根、懸浮細胞等可導入或沉默相關代謝途徑中的基因，以此來產生更多的次生代謝產物。二者的相輔相成可擴大柴胡皂苷的來源，進而提高和保證藥材質量，這也是解決如今柴胡資源混亂、野生資源匱乏的重要途徑。柴胡應用廣泛，藥效明顯。因此其不定根培養(yǎng)、毛狀根培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)等技術的研究與應用具有廣闊前景。但每種植物都有其特殊性，每種植物的誘導模式?jīng)]有固定模式可循，且受多種因素影響，因此，在柴胡生物培養(yǎng)技術領域還有很多方向值得研究。由于不定根的特殊形態(tài)，在傳統(tǒng)容器內培養(yǎng)可能不利于其增長，生物反應器可為不定根提供良好的生長環(huán)境[41]。同為根類入藥的人參，在不定根培養(yǎng)過程中應用生物反應器的方式已經(jīng)成熟，且研究得知應用生物反應器可提高人參不定根中皂苷類成分的含量[42]。目前利用生物反應器培養(yǎng)柴胡不定根、愈傷組織、毛狀根的研究尚未見報道，可嘗試應用此方法來提高柴胡組織的培養(yǎng)效率。毛狀根培養(yǎng)技術發(fā)展時間較短，但柴胡的毛狀根培養(yǎng)體系還需優(yōu)化。目前柴胡大多采用外植體接種法產生毛狀根，但此方法要求在嚴格無菌環(huán)境下操作且耗時較長。提示柴胡的毛狀根培養(yǎng)體系優(yōu)化及考察還需深入研究。藥用植物丹參近期已有原位土培侵染產生毛狀根的報道，在植株生長的自然條件下即可侵染產生毛狀根，這種方法省時、簡單、便于操作[43]。說明開發(fā)柴胡新的毛狀根誘導途徑成為可能，但柴胡毛狀根是否可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)柴胡藥材應用還需要考證。黃志成等[44]在丹參毛狀根與丹參藥材進行對比的實驗中發(fā)現(xiàn)，不添加誘導子或添加Ag+，脫落酸（ABA）和YE等誘導子產生的毛狀根與丹參藥材的指紋圖譜相似度并不高，甚至很低，且有效成分含量大幅低于藥材。研究柴胡內生真菌或許可開發(fā)新種類的抗生素、擴大柴胡次生代謝物生產途徑，具有廣闊的推廣前景。植物內生真菌是指其在生活史中某一段時期生活在植物組織內，對健康植物組織不引起任何病害癥狀的所有真菌。和植物體存在一定的寄生關系，很多真菌帶有植物體的酶系，不僅可以促進植株生長、賦予植株抗逆性，還可以產生和寄主植物相同的次生代謝產物。目前，已有初步分離野生柴胡[45]及狹葉柴胡[46]內生真菌的報道，并且初步驗證其中一些菌類有抗菌活性，但還需更加深入的研究。研究柴胡內生真菌或許可開發(fā)新種類的抗生素、擴大柴胡次生代謝物生產途徑，具有廣闊的推廣前景。隨著技術的發(fā)展及研究的深入，基因組學和轉錄組學、蛋白質組學、生物信息學等生物技術的不斷發(fā)展和融合[47-48]，其將越來越廣泛地應用于柴胡皂苷生物合成途徑研究中，為柴胡次生代謝工程的研究注入新活力，同時，技術的快速發(fā)展為柴胡次生代謝物的大量合成提供了新思路和新工具。合成生物學最終的目的是要用于生產，在投入生產前還需進行一些必要研究，首先要找到完整的合成途徑，其次可利用最新的CRISPR/Cas等技術對工程菌進行改造，通過對調控柴胡皂苷有影響的因素進行研究，找到合適的高產載體作物，將合成工藝系統(tǒng)進行優(yōu)化，最終實現(xiàn)生產。

作者：王晨 安立成 李劍超 戚文濤 劉長利 李莉 單位：首都醫(yī)科大學