細胞培養中透明質酸探究范文

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《影像科學與光化學》2016年第3期

摘要：

通過觀察生物體內骨的電鏡圖片，發現骨表面具有豐富的纖維微納結構，在此觀測的啟發下，本實驗設計將二氧化鈦表面生物活性化的同時構筑這種纖維微納結構，模仿骨表面。考慮到二氧化鈦具有光催化性，且具有生物無毒性，本實驗采用“自上而下”的一步法，在紫外光照的條件下，將二氧化鈦靜電紡絲與透明質酸衍生物在光照條件下通過雙鍵穩定地連接起來。傅立葉－紅外光譜分析表明實驗成功地在二氧化鈦靜電紡絲表面嫁接上透明質酸分子。通過熒光和掃描電鏡分析表明，間充質干細胞可以很好地在二氧化鈦靜電紡絲和透明質酸的復合結構上生長。這種構筑復合結構表面的方法，生物活化了二氧化鈦紡絲的表面，同時模仿骨表面獲得了微納纖維拓撲結構。此外，可以將二氧化鈦靜電紡絲紡在不同種類的材料表面，從而在不同材料表面簡便地得到可用于細胞培養的纖維表面結構，對于未來可實際應用的移植材料研發具有很好的借鑒意義。

關鍵詞：

二氧化鈦靜電紡絲；透明質酸；紫外光引發；細胞培養

時至今日，研究生物體系與材料界面的作用機理和規律成為了組織醫學工程的重要課題。根據眾多的科學文獻報道，微納圖案化材料在組織醫學工程、人工生物體內移植材料等領域中都有了廣泛的應用，對人工體內骨移植、人造血管、牙齒種植等方面都具有重大的推進作用。現在，來自多個領域的科研工作者將從不同的研究領域和角度共同探討研究生物體內外的各種生物界面組成。在眾多研究中，具有微納結構的人工移植材料具有刺激并調控細胞行為的作用，這些微納結構很好地加強了材料與組織的相容性，具有很強的應用價值。有關的一系列工作包括構筑特殊的微納圖案化表面誘導干細胞的定向分化；利用特殊的圖案化基底在體外培養體細胞，使其恢復并具有多能分化性，最終成為多功能干細胞用于體內的疾病治療、器官組織恢復；將體內移植材料表面上構筑特殊的微納圖案化結構，使體內細胞在移植材料表面的黏附更加順暢，并減少機體因移植物而出現的免疫排斥現象，達到促進組織與材料相容性的目的［1－4］。但是，微納結構的表面構筑具有成本高、耗時長、可構筑范圍有限等諸多不利因素，同時用于移植的材料本身在無生物毒性以外，還需要具有較好的生物相容性，比如眾多金屬移植材料的機械強度很好，但是具有生物毒性，聚合物材料聚醚醚酮具有生物無毒性且表面的力學性質與骨表面相似，但是材料本身卻具有生物惰性。考慮到以上眾多問題，本實驗設想在構筑微納結構的基礎上改性材料表面的性質，使細胞更易在材料表面黏附、增殖，完成一系列的生物行為。

本文工作采用原位聚合的方法將接有雙鍵的透明質酸（透明質酸甲基丙烯酸酯）構筑在二氧化鈦靜電紡絲的表面，選取Wistar大鼠的間充質干細胞作為實驗用細胞來評價所研究材料的生物相容性。透明質酸是生物體內一種常見的生物大分子，在細胞外基質中廣泛存在［5－8］，考慮到二氧化鈦具有光催化性，且具有生物無毒性，我們在紫外光照的條件下通過“自上而下”一步法，將二氧化鈦靜電紡絲、透明質酸衍生物兩者用化學鍵穩定地連接起來。這種構筑復合結構表面的方法，生物活化了二氧化鈦靜電紡絲的表面，同時模仿骨表面獲得了微納纖維拓撲結構。此外，可以將二氧化鈦靜電紡絲紡在不同種類的材料表面，從而在不同材料表面簡便地得到可用于細胞培養的纖維表面結構，對于未來可實際應用的移植材料研發具有很好的借鑒意義。

1實驗部分

1．1試劑與儀器

去離子水，透明質酸鈉（上海拜力生物科技公司），甲基丙烯酸酐（西格瑪奧德里奇），聚乙烯吡咯酮，鈦酸四丁酯（麥克林），醋酸（99％，阿拉丁），1×PBS，丙酮（分析純，北京化工廠），乙醇（分析純，北京化工廠），過硫酸銨（APS）（阿拉丁），牛血清白蛋白（BSA）（西格瑪奧德里奇），鬼筆環肽，DAPI，氫氧化鈉（分析純，上海阿拉丁），水合氯醛（分析純，北京化工廠），戊二醛（分析純，北京化工廠），青霉素－鏈霉素（簡稱雙抗，Hyclone公司），DMEM－F12培養基（Gibco），胎牛血清（Gibco），胰蛋白酶（0．25％，Hyclone）。高壓電源（東文天津有限公司），馬弗爐（安賽斯北京科技有限公司），傅里葉紅外光譜儀，CO2臨界點干燥儀，微電子天平，環境掃描電子顯微鏡，原子力顯微鏡，二氧化碳培養箱，熒光倒置顯微鏡（尼康），單光子激光共聚焦顯微鏡（蔡司），超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋，制冰機，全自動酶標儀，紫外燈。

1．2合成透明質酸甲基丙烯酸酯

將透明質酸鈉配制成1％質量濃度的溶液（所用溶劑為去離子水），向配制好的溶液中加入額外10倍體積的甲基丙烯酸酐，將溶液體系的pH調整為8左右，混合后的體系使用透析袋（分子量6～8kDa）進行純化，得到的目標產物使用凍干機進行冷凍干燥，得到白色類棉花的絮狀物，這些絮狀物就是透明質酸甲基丙烯酸酯［9，10］。將最終產物溶于去離子水制備成2％質量濃度的溶液待用。

1．3制備二氧化鈦靜電紡絲薄膜

將分子量為1300000的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0．3g放入帶有磁力攪拌子的潔凈的小錐形瓶中，加入5mL無水乙醇，加蓋封閉并進行磁力攪拌直到得到均一透明的液體。將3mL鈦酸四丁酯和5mL冰醋酸同時緩慢滴加到小錐形瓶中，經過2h的磁力攪拌后會得到均一澄清的黃色液體。將黃色液體移入用于電紡的注射器中，注射器所配備的針頭為0．7mm的鋼制針頭。針頭與承接電紡絲的硅片距離為12cm，注射泵的推進速度為0．5mL•h－1，加載在兩端的電壓為15KV，經過5h的電紡，得到含有PVP和鈦酸四丁酯的靜電紡絲薄膜。將靜電紡絲薄膜與硅片一起放入馬弗爐中，在500℃的溫度下煅燒2h，得到二氧化鈦靜電紡絲薄膜［11］。硅片上的薄膜可以用鑷子輕輕揭起，密封保存。薄膜很薄需要小心處理，很容易發生斷裂。

1．4制備透明質酸和二氧化鈦靜電紡絲的復合結構

將透明質酸甲基丙烯酸酯溶液作為工作液，向覆蓋有二氧化鈦靜電紡絲的硅片表面滴加工作液至覆蓋表面，置于1000W紫外燈下照射4min，工作距離5cm。由于二氧化鈦靜電紡絲具有光引發性［12］，在紫外光的照射激發下，會使其在表面產生自由基，從而與周圍帶有雙鍵的透明質酸單體發生聚合反應，使兩者穩定的連接在一起。將紫外光照射后的樣品取出使用去離子水清洗3遍，每遍3min，洗掉沒有反應的單體，如圖1所示。清洗后，使用氮氣吹干以備待用。對于用于細胞實驗的樣品，將其高壓滅菌或者使用低功率紫外燈照射5h左右。

1．5表面性質檢測制得的樣品

使用傅里葉紅外光譜儀在700～4000cm－1的范圍內，4．0cm－1分辨率下進行檢測。表面圖像使用環境掃描電子顯微鏡（ESEM）在低真空模式下進行檢測，加載的電壓為8kV，樣品在測試前要提前蒸鍍上2nm左右厚度的鉑金層加強導電性。

1．6鼠骨髓間充質干細胞的分離和培養

將提取細胞所使用的器械進行高壓滅菌處理，超凈臺在使用前利用紫外燈殺菌40min，取60～80g雄性Wistar大鼠，對大鼠腹腔內注射5％水合氯醛2．5mL，待老鼠麻醉不動后將其斷頸處死。在超凈臺中，利用剪刀剪取其雙側股骨和脛骨并使用針管提取骨髓，將提取出的骨髓過濾至15mL離心管中。在以1300轉／min的速度離心后，將其分散到配備好的DMEM－F12培養基中（15％胎牛血清，1％雙抗），放于細胞培養箱（5％CO2，37℃）中進行培養。第二天全換液，換掉雜質細胞，第4天全換液替換掉雜質細胞，然后通過觀察細胞的成長情況，每2天換一次液。細胞長滿培養皿后，使用胰酶進行傳代，當細胞傳代到第4代時可以使用，接種到材料表面進行后續試驗。將修飾有二氧化鈦靜電紡絲和透明質酸衍生物的硅片放入24孔培養板中，每個孔中加入1mL消化下來的細胞懸浮液（50000細胞／mL），將孔板放入細胞培養箱（5％CO2，37℃）進行培養，每2天換一次液［1，13］。

1．7基底細胞掃描電鏡分析

將上述細胞培養24h后的不同基底從孔板中取出，使用PBS清洗表面一次除去多余培養基，使用5％戊二醛固定樣品，浸泡不同基底過夜，固定后使用PBS清洗基底3次，一次2min除去多余的戊二醛；清洗后的樣品使用30％、50％、75％、80％、95％、100％濃度的酒精進行梯度脫水，每個濃度的脫水時間15min到20min，梯度脫水后保存在無水乙醇中；將保存在無水乙醇中的樣品轉移至CO2臨界點干燥儀中進行干燥；干燥后的樣品使用環境掃描電鏡進行表面分析。

1．8基底細胞熒光分析

將間充質干細胞接種在不同的基底表面24h后，樣品用PBS清洗10min，除去表面多余的培養基；樣品使用4％的多聚甲醛固定15min，固定后用PBS清洗3遍，每遍10min，以除去多余的多聚甲醛；清洗完后樣品用0．1％TritonX－100在室溫條件下破膜，破完膜后用PBS清洗3遍，每遍5min；使用1％的牛血清白蛋白在室溫條件下對樣品封閉2h，封閉后使用PBS清洗3遍，每遍5min；將清洗過的樣品使用鬼筆環肽（儲備液1∶40，用PBS稀釋后使用），在避光處進行細胞骨架染色40min，染色后使用PBS清洗3遍，每遍5min，清除多余的染料；使用DAPI（儲備液1∶100稀釋）染色細胞核10min，染色后使用PBS清洗3遍，每遍5min；染色后的樣品保存到甘油或直接使用激光共聚焦顯微鏡進行觀測［1］。

2結果與討論

2．1紅外吸收光譜

二氧化鈦具有自引發性，在紫外光照條件下會產生活性自由基團并與透明質酸甲基丙烯酸酯所帶有的雙鍵基團發生加成反應［14］，經過紫外照射4min后二氧化鈦靜電紡絲就會通過化學鍵穩定地嫁接在親水的透明質酸分子鏈上。傅里葉紅外光譜儀的測量用來描述基底表面的分子嫁接情況，如圖2所示，在3370cm－1附近有很強的吸收峰，這正是由羧基引起的。這些數據表明透明質酸成功地修飾在二氧化鈦靜電紡絲上。

2．2二氧化鈦靜電紡絲和透明質酸纖維復合結構掃描電鏡

為了評價修飾透明質酸后的二氧化鈦靜電紡絲的表面形貌特性，我們對修飾后的表面進行掃描電鏡的觀測。圖3（a）是修飾后的二氧化鈦靜電紡絲表面，與圖3（b）的真實骨表面比較我們會發現，真實骨表面充斥著豐富的纖維結構，修飾后的二氧化鈦靜電紡絲纖維結構很好的模仿了這一點。我們知道基底的納米結構所產生的形貌不對稱會促進細胞的極化現象，而細胞的極化會促進細胞的分化趨勢，我們有理由相信修飾后的二氧化鈦靜電紡絲纖維結構表面能夠很好地促進細胞分化的趨勢［15－17］。

2．3細胞電鏡圖片

對細胞的骨架和細胞核進行雙染色，利用環境掃描電鏡對間充質干細胞在不同基底的細胞形態學情況進行了分析。如圖4所示，在修飾后的二氧化鈦靜電紡絲表面上細胞鋪展情況很好，通過掃描電鏡圖片觀察可以發現纖維結構上的細胞偽足（包括板狀偽足、絲狀偽足）充分鋪展。偽足的鋪展情況直接影響細胞的穩定粘附、遷移、分化等細胞行為，對于偽足黏附情況較差的材料，無疑在細胞應用方面也是極其不利的，而細胞的偽足在修飾有透明質酸的二氧化鈦紡絲結構表面鋪展情況很好，這證明了生物活性化的二氧化鈦靜電紡絲表面能夠提供給細胞更多的黏附位點，也可以認為仿骨表面的納米纖維拓撲結構從結構角度講具有促進干細胞成骨分化的作用。

2．4細胞熒光圖片

如圖5所示，通過觀察熒光圖片可以發現，接種在二氧化鈦靜電紡絲和透明質酸纖維復合結構上的細胞核和骨架的熒光圖像很明顯，骨架與核的輪廓很清晰，這說明細胞在纖維結構表面的生長狀況良好，而且細胞的核與骨架具有很高的長徑比，這主要是由于二氧化鈦靜電紡絲的表面富含不對稱的納米纖維拓撲結構，較高的長徑比使得細胞骨架更加容易發生極化現象，而極化現象的產生會加速細胞的分化程度，使得干細胞在表面的成骨分化導向更加強烈［18］。通過數據分析有理由相信，二氧化鈦靜電紡絲和透明質酸纖維復合結構具有生物相容性的同時還具有促干細胞成骨分化的能力。

3結論

本文采用“自上而下”的一步構筑法，在紫外照射條件下成功地將二氧化鈦靜電紡絲與生物活性分子透明質酸結合起來。生物活性分子的修飾大大提高了細胞在靜電紡絲表面的黏附、鋪展、增殖等生物行為，此外，二氧化鈦靜電紡絲自有的納米纖維拓撲結構極大的促進了間充質干細胞的分化導向，同時由于制作方法簡單使得這種構筑手段可以應用于各種生物活性較差移植材料表面。本文的工作成功地構筑了具有生物活性的納米纖維結構，并且引入了納米拓撲結構，這種結構可以用于改善生物惰性問題，在力學與納米結構的復合作用下能夠更好地促進干細胞的分化導向，而且使用的一步構筑方法操作簡便，對于移植材料的表面構筑具有一定借鑒意義。

作者:劉思迪 張俊虎 單位:吉林大學化學學院超分子結構與材料國家重點實驗室