細胞增殖論文范文

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第1篇

【關鍵詞】骨髓內皮細胞GMCSF細胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有許多報道證明內皮細胞（endothelialcells,EC）、內皮祖細胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用來治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血［1,2］也可以用于組織工程的血管構建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］報道，EPC對缺血心臟病進行治療具有良好的效果，一方面減少了缺血組織的面積，同時改善了心臟的功能。Kalka等［5］則報道了利用EPC對肢體缺血的小鼠模型進行治療，實驗結果表明了EPC能顯著增加缺血肢體的灌流，而且組織學檢查發現缺血部位毛細血管的數目也大大增加。內皮細胞的來源有多種，可以從外周血、臍血及骨髓中獲得［6］，而外周血中的內皮祖細胞來源于骨髓。從病人自體的骨髓中獲得內皮細胞，一方面來源比較方便，而且也可以避免GVHD的發生。但是由于骨髓基質細胞種類多，難以分離純化骨髓內皮細胞或內皮祖細胞。本研究用本實驗室配制的內皮細胞培養液（EndoM）體外培養小鼠骨髓細胞，分離純化骨髓內皮細胞及內皮祖細胞，并觀察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）對小鼠骨髓內皮細胞體外增殖的影響以及體外增殖后內皮細胞增殖機能的改變，這對臨床運用內皮細胞或內皮祖細胞治療疾病有一定的指導意義。

動物

昆明小鼠，由中南大學湘雅醫學院動物學部提供，雌雄不限，普通飲食。

主要試劑和儀器

IMDM為Gibco公司產品；新生牛血清購自杭州四季清生物制品研究所；重組小鼠粒巨噬細胞集落刺激因子（rmGMCSF）為R&D公司產品；vWF抗體、CY3標記的羊抗兔IgG為Sigma公司產品；MTT、二甲基亞砜（DMSO）為Sigma公司產品；酶標儀為Awarens公司產品；CO2培養箱購自美國Forma。

小鼠骨髓內皮細胞及內皮細胞集落的培養

用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出股骨，用IMDM沖出骨髓細胞，制成單細胞懸液，取1×106個小鼠骨髓單個核細胞種入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培養體系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天后,用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按每孔1×104個細胞種入24孔板，每組3孔。于二氧化碳培養箱內培養15天后計數內皮細胞集落數，以≥50個細胞的聚合計為1個集落。

內皮細胞的形態觀察及vWF的檢測

培養的骨髓內皮細胞集落經WrightGiemsa染色后，顯微鏡下觀察內皮細胞形態。用間接免疫熒光法檢測骨髓內皮細胞vWF。將內皮細胞培養于24孔板內放置的蓋玻片上，當細胞間沒有明顯的間隙時，取出蓋玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分鐘，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封閉4小時，加入vWF抗體，4℃過夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分鐘,PBS洗3次：置于熒光顯微鏡下觀察。以本室建的小鼠骨髓內皮細胞株［7］為陽性對照，骨髓成纖維細胞為陰性對照。

不同濃度的GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞形成集落的影響

取純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于24孔板中，每孔5000個細胞，在基本培養體系（含1%濃度EndoM）的基礎上分別加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，對照組不加入GMCSF，每組3孔。置于CO2培養箱培養15天，于倒置顯微鏡下記數集落數，≥50個細胞的聚合計為1個內皮細胞集落。

GMCSF對內皮細胞增殖影響的MTT法測定

將純化的小鼠骨髓內皮細胞按5000個/孔培養于96孔板，每孔0.2ml，每組3孔。實驗組培養體系中分別加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，對照組內不加。在37℃、5%CO2、飽和濕度下分別培養5天和10天，取出培養板吸去培養液，然后加入無血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培養箱孵育4小時，吸去液體，各孔加入DMSO150μl，振蕩10分鐘，使結晶充分溶解。選擇492nm波長，在酶標儀上測定各孔的光吸收值（OD492）。

生長曲線

純化的小鼠骨髓內皮細胞培養于96孔板中，每孔5000個細胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培養液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共種6組，每組3孔，培養5天后，分別于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后計數細胞，每次3孔，求平均值，做出生長曲線。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代內皮細胞生長的倍增時間。

細胞周期的流式細胞術檢測

無菌條件下取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml培養體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入兩種不同培養體系，對照組加含15%新生牛血清的IMDM，實驗組加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每組各10孔，置于CO2培養箱培養3天后，用胰酶消化細胞，200×g,離心5分鐘，用PBS洗滌細胞2次之后，用300μlPBS重懸細胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）約700μl（終濃度為70%），將細胞放于-20℃過夜處理后，用流式細胞儀檢測細胞周期。

細胞傳代培養

取小鼠骨髓單個核細胞，按2×106個細胞種于6孔培養板中（2ml體系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養5天，然后吸去培養液，加入15%新生牛血清的IMDM培養液和100ng/ml的rmGMCSF，促使細胞融合，再按1∶4傳代于6孔板中，同樣加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等細胞生長至融合，按1∶4傳代，加入相同培養體系。按上述方法傳4代后，繪制生長曲線，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代內皮細胞生長的倍增時間，并與第1代的倍增時間進行比較。

統計學處理

實驗數據為3次結果，以mean±SD表示。不同處理組兩組間比較采用t檢驗，應用SPSS軟件分析，P<0.05表示有統計學意義。

結果

細胞形態每孔種入小鼠骨髓內皮細胞5000個，對照組加基礎培養液,實驗組在基礎培養液的基礎上分別加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。與對照組相比，實驗組集落數均明顯增多（圖3），說明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞的增殖有明顯刺激作用。

rmGMCSF對內皮細胞增殖的影響

小鼠骨髓內皮細胞培養5、10天，分別進行MTT的檢測，結果表明rmGMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長促進作用明顯，各組與對照組相比差異顯著（P<0.01）（圖4）。

GMCSF對EC細胞周期的影響

運用流式細胞儀檢測細胞周期，觀察GMCSF對EC細胞周期的影響。結果顯示GMCSF使細胞進入S期的比例為9.3%，與對照組2.1%相比有明顯差別。此結果說明GMCSF能夠促使細胞進入S期，加快細胞的分裂，從而促進了細胞的增殖（圖5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

體外擴增傳代對內皮細胞增殖的影響

圖6為小鼠骨髓第1代和第4代內皮細胞的生長曲線。利用計算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］計算出第1、4代細胞生長的倍增時間分別為30.25±0.55小時、31.67±0.26小時。第1代與第4代的細胞倍增時間相比，無明顯差異，表明經體外擴增傳代4次，仍能保持傳代早期的增殖潛能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.討論

國內外對于骨髓內皮細胞的純化報道較少，但已經進行了一些關于細胞因子對內皮細胞增殖影響的研究，如Yonekura等［8］報道VEGF可以促進內皮細胞的增殖，Rieck等［9］則報道bFGF可促進角膜內皮細胞的生長。我們此前曾報道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等對內皮細胞株的增殖有促進作用［10］。GMCSF對未經轉化的骨髓內皮細胞增殖的作用尚未見報道。本研究中，我們用本室配制的培養基在較短的時間內純化了小鼠的骨髓內皮細胞，vWF為陽性，并在此基礎上觀察了GMCSF對骨髓內皮細胞增殖的影響。應用基本培養基培養內皮細胞集落時，形成的集落數較少，加入rmGMCSF后，集落生成明顯增多。MTT的結果亦支持GMCSF對小鼠骨髓內皮細胞生長的刺激作用。細胞生長曲線的結果表明，在含GMCSF培養的條件下，內皮細胞生長的倍增時間為30.25±0.55小時，經4次傳代后細胞倍增時間無明顯延長，表明體外培養擴增4代后，細胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF對骨髓內皮細胞的體外增殖有明顯刺激作用。文獻報道內皮細胞表面有GMCSFR的存在，而內皮細胞本身也可以分泌GMCSF［11］。結合細胞周期測定的結果，可以認為，GMCSF促內皮細胞增殖的機制可能是GMCSF與GMCSFR結合，通過細胞內信號傳遞使更多的細胞進入S期來實現的。

【參考文獻】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王綺如，嚴燕，汪保和.小鼠骨髓內皮細胞系的建立.中國實驗血液學雜志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

第2篇

【關鍵詞】人乳鐵蛋白；癌細胞；細胞增殖

人乳鐵蛋白(HumanLactoferrin，hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白，乳汁別是初乳中含量最高，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。國外有學者將其應用于腫瘤患者的治療，但是對其作用機制的研究較少。目前國內較少有關于hLF作用于細胞的報道，我們選用易早期轉移的鼻咽癌(NPC)細胞作為研究對象，以中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人肝臟細胞(L02)作為正常細胞對照，觀察hLF在體外是否具有抑制癌細胞生長的作用，探討hLF抗腫瘤的作用機制，從而為腫瘤的治療提供研究基礎，為臨床實驗及應用提供新的理論依據。

一、材料與方法

1.1材料人鼻咽癌細胞(CNE)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人肝臟細胞(L02)均購自中國科學院上海細胞資源中心。重組hLF(Lot:L0520，溶于PBS中，儲存濃度5mg/ml，-20℃儲存備用)和噻唑藍(MTT，Lot:M2128)均購自Sigma公司。RPMI1640、胎牛血清購自HyClone公司。其他試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養各細胞系均應用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI1640培養基，5%CO2，37℃培養。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖設空白對照組和hLF干預組。待細胞生長至對數生長期，接種于96孔細胞培養板，接種數為5×104/孔。每組細胞設5個平行孔，各組細胞分別加入不同濃度的hLF(0，1.25×10-3,2.5×10-3，5×10-3，10×10-3，20×10-3，40×10-3g/L)，每孔均為200μl。作用24h后，加入MTT(5g/L，每孔20μl)，繼續培養4h，測定A570nm吸光度。

1.2.3細胞形態觀察細胞經hLF處理后，傾去上層懸浮死細胞并用PBS洗兩遍，加入新鮮培養基。同樣處理對照孔細胞，將細胞置于倒置顯微鏡下，觀察細胞形態的變化。

1.3統計學處理數據用x±s表示，組間比較用方差分析。

二、結果

2.1重組hLF對鼻咽癌細胞CNE、人肝臟細胞L02、中國倉鼠細胞CHO系的增殖能力的影響對CNE呈現劑量依賴性的抑制作用，而對正常細胞無抑制作用。人乳鐵蛋白對各細胞體外增殖的影響與空白對照比較:1)P<0.05

2.2細胞形態學觀察顯微鏡鏡下可見，空白對照組癌細胞密集成片生長，如鋪路卵石狀，細胞膜圓潤，透明，顆粒較少，細胞間界限清楚，并可隱約見到細胞核。hLF處理組癌細胞形態發生明顯的改變，隨hLF濃度增加，細胞從正常的增殖旺盛的貼壁生長，逐漸表現為生長緩慢，黏附力降低，細胞變圓，細胞胞質粗糙，細胞內顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差，細胞形態完整性受損，而正常細胞在細胞鏡檢圖hLF作用下無顯著變化。

三、討論

hLF多種生物學功能通過免疫系統的激活與調節得以實現。Bezaul研究發現，乳鐵蛋白能抑制鼠實體瘤的生長和轉移。腫瘤內注射LF，可以明顯的減小實體瘤的體積，且作用效果與LF干預天數相關。研究發現，乳鐵蛋白的抗頭頸部腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖實現的。Wolf等發現，人乳鐵蛋白通過阻斷頭頸部腫瘤細胞由G0到G1期的轉化來抑制腫瘤細胞的增殖。人乳鐵蛋白對鼠的SCC細胞系生長的抑制作用，與劑量成正相關；而且人乳鐵蛋白抑制頭頸部細胞癌的作用是通過直接的細胞毒作用及系統性的免疫調節作用實現的。

Varadhachary等人做了大量的口服臨床試驗，證實乳鐵蛋白無藥物相關的有害作用。鼻咽癌作為頭頸部腫瘤之一，其惡性程度較高，早期即可出現頸部淋巴結轉移，臨床上有轉移至骨盆、肺、肝等多器官的病例。選用鼻咽癌細胞作為研究對象，具有一定的代表意義。

本研究結果顯示，人乳鐵蛋白可以抑制鼻咽癌細胞增殖，且呈劑量依賴性，對正常細胞的增殖無明顯抑制作用。這一結果，為開發乳鐵蛋白的抗癌功效提供了理論依據。

【參考文獻】

第3篇

固定資產折舊額，是固定資產磨損價值貨幣表現，在一定時期內提取折舊的數額，取決于固定資產的規模與固定資產的磨損程度，這是傳統會計核算折舊額時所遵循的原則。但在通貨膨脹、物價上漲過快的條件下，計算折舊時，除了仍應遵循上述基本原則外，還應當考慮通貨膨脹、貨幣貶值的因素，因為只有這樣，才能保證所提折舊基金，能夠從使用價值上恢復原有規模。如1985年投資100萬元，購買每輛載重噸位4噸的10輛載重汽車，壽命期為10年，提取折舊100萬元，1995年這批汽車報廢，由于物價上漲，再用這100萬元折舊額就無法購買具有原使用價值的10輛載重汽車。因此，在新的條件下，折舊額應當要保證固定資產原有使用價值得以補償，這是折舊額應當遵循的原則之一，同時，亦是資產保值應遵守的準則。

二、折舊額的核算方法

（一）固定資產磨損價值貶值的量變規律。

為了正確地核算折舊額，即在通貨膨脹條件下，能抵補貨幣貶值的損失，在固定資產壽命期各個時間階段上所計算的折舊額之和，能夠滿足從使用價值上恢復原有固定資產規模的需要，這首先就需要分析固定資產磨損價值貶值的量變規律。

固定資產是長期使用的物質資料，而生產性的固定資產是物質產品生產過程中的勞動資料。因而，固定資產再生產的過程是：

購置建造一交付使用一報廢一再購置建造。

從上述過程可以看出：建（購）置是固定資產原始價值的始點，報廢是固定資產原始價值的終點。在壽命期中，固定資產每年在提取折舊后，其金額必要產生一個無形貶值量。這個貶值量的變化過程可用公式表示如下：

式中：Z代表固定資產原值；Z’代表貨幣貶值的損失量；Y代表年折舊額；L代表物價上漲率；l，2…n代表時序；n代表固定資產使用年限。

在通貨膨脹條件下，為了避免固定資產貶值的損失，在核算折；日時，應當把貶值（Z’）加到折舊額中，進入產品成本，待產品出售后，收回折舊以滿足更新固定資產的需要。

（二）核算折舊的公式設想。

上面從遞減折舊的觀點，考察固定資產逐年遞減的貶值量的變化規律的，但為了正確計算年折舊額，可以從另外一個角度觀察這個問題，即一方面以整個固定資產原值為基數，隨著時間的推移，由于通貨膨脹，貨幣貶值，可把逐年貶值量加到固定資產原值中去，使固定資產從其生命的始點到生命的終點，仍能保值。另一方面每年提取的折舊額，從第～年末開始，直至折舊終止為止亦逐年加進一個貶值額，并假定固定資產在報廢時無殘值，則可建立如下公式：

把上述方程作為如下整理，則：

整理后簡得：

現仍以本文前面購買10輛汽車為例：

Z=100萬元，n=10年

則該批汽車的年折舊額為：

計算結果，每年提取13．8909萬元，在10年物價總水平上升87．186%的條件下，在10年后仍然能夠購買載重量為4噸的10輛載重汽車。然而按傳統的方法計算折舊，即100萬元10年=10萬元，在通貨膨脹條件下，所計算的折舊總額，是無法按照原有固定資產使用價值規模更新全部固定資產，即無法保證固定資產保值的。

三、核算折舊額的幾個具體問題

通過實例證明，筆者認為上面所設計并經過推導，論證所建立的在通貨膨脹條件下，計算折舊額的公式是科學的，但在應用公式時，仍有下列問題需做進一步的研究。

（一）價格指數的選擇。

通貨膨脹，物價上漲，這是一個普遍的問題。但在現實經濟生活中，由于各種商品在國計民生中的作用不同，因而其物價上漲幅度是不相同的。因此，在我國實際工作中編制有各種性質的價格指數。那么在計算固定資產折舊額時，應當采用哪種價格指數為宜呢？筆者認為，應當采用國家統計局編制的固定資產投資價格指數。這一指數綜合反映我國固定資產投資價格的變動程度，而且與折舊額的聯系最為密切。

（二）固定資產貶值率總額。

固定資產折舊的計算是一個十分重要經濟問題，它關系到正確評價企業經濟效益與國家財政收入等問題。因此國家財政部門應當根據固定資產投資價格總指數與分類指數，考慮到未來一段時期內經濟發展的趨勢，對價格變動作出預測，并以定額參數的形式公布，供各企業計算折舊時采用。當然我們不否認制定定額參數即貨幣貶值的定額參數是十分復雜的工作。但為了保證這項工作的準確性與科學性，可以在預測的基礎上經有關專家討論，爾后經有關權威機構批準，再行公布采用。

（三）定額貶值率與實際貶值率的問題。

貨幣定額貶值率與實際貶值率是要發生離差的，因此，根據定額貨幣貶值率計算的折舊額和實際貨幣貶值率計算的數值之間，必須要產生一個差數，為此需要調整。一般來講，在年度執行過程中，可按貨幣定額貶值率計算，待年終決算時，再根據實際貨幣貶值率進行調整，其公式如下：

YI=Y[l＋（L1－L）]

式中：YI代表調整后的折舊額；Y代表按貨幣定額或預計貶值率折舊額；LI代表實際貨幣貶值率；L代表定額貨幣貶值率。

設Y=13．8909萬元；L1＝0．07；L＝0．0647