細胞生物學論文范文
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第1篇
RT-PCR檢測耐藥相關基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表達取對數生長期細胞，TRIzol試劑提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，SYBYGreen方法進行實時熒光定量PCR實驗。引物設計由Invitrogen公司合成，見表1。PCR反應體系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的終濃度各為15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循環設置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40個循環（生成擴增曲線）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲線）。SDS2.2軟件分析處理數據，管家基因校正目的基因的表達，得到相對定量結果。1.6耐藥細胞的保存耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存于含0、10、30nmol/L紫杉醇藥物的凍存液里。于凍存后1、3、6月分別復蘇細胞，觀察復蘇情況，MTT法檢測IC50。1.7統計學方法對有關數據采用SPSS13.0軟件進行獨立樣本t檢驗（independentsamplet-test）、單因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。
2、結果
2.1耐藥細胞的建立
SKOV3經300μg/ml大劑量的紫杉醇作用2h后,大部分細胞死亡漂浮，剩余細胞腫脹，伸出樹枝狀突起呈蜘蛛狀，胞質見空泡形成、顆粒增多。少量存活的細胞克隆生長，恢復生長至對數期消化傳代，再進行下一次沖擊；SKOV3經10~30nmol/L小劑量的紫杉醇作用24h，約50%的細胞死亡，細胞體積增大，形態不規則，胞質內顆粒增多，貼壁性變弱，給藥24~72h內最明顯，96~120h后逐漸恢復原狀。經兩種誘導方法獲得的耐藥細胞系，分別命名為SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐藥細胞的生物特性
2.2.1耐藥指數MTT實驗結果顯示，耐藥細胞及其敏感細胞的IC50值及耐藥指數，可見小劑量濃度遞增誘導的耐藥細胞SKOV3/TAX30耐藥性較強，見表2。2.2.2平板克隆形成實驗在無藥物作用時，SKOV3敏感細胞較兩種耐藥細胞系的克隆形成能力強，見圖1A的d組，SKOV3敏感細胞的克隆形成數為（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成數為（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成數為（579±9.50）。與敏感細胞SKOV3相比，兩種耐藥細胞克隆形成數少，差異有統計學意義（P均=0.000），見圖1B。而在相同濃度紫杉醇作用下，耐藥細胞形成的克隆明顯多于敏感細胞。在紫杉醇濃度為5nM時，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）個克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）個克隆，而SKOV3形成的克隆數僅（202±6.08），差異有統計學意義（P均=0.000）；當紫杉醇濃度進一步升高為50nM和500nM時，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆數仍明顯高于敏感細胞SKOV3。紫杉醇濃度為50nM時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300細胞形成的克隆數相比，差異有統計學意義（P=0.013）,SKOV3細胞與SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數相比，差異也有統計學意義（P=0.000）；紫杉醇濃度為500nmol/L時，SKOV3細胞與SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞形成的克隆數相比，差異有統計學意義（P=0.009、0.0001），見圖1B。2.2.3生長曲線倍增時間的差異SKOV3敏感細胞和兩種耐藥細胞系在相同條件下培養7天，細胞增殖產生一定的差異。耐藥細胞的生長較敏感細胞減慢，生長曲線的斜率減小，見圖2。同時，根據生長曲線計算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞的倍增時間分別為28.90h、24.0h，與敏感細胞的倍增時間20.84h相比也有所延長。
2.3耐藥相關基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各細胞中的表達MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30細胞中的相對表達豐度見圖3A、3B。兩種耐藥細胞中，MDR1的表達明顯增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30對紫杉醇的耐藥與MDR1高表達有關。SKOV3/TAX300細胞中PRKCA、LRP的表達均高于SKOV3細胞，差異有統計學意義（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表達與敏感細胞比較，差異無統計學意義（P=0.815）。而SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統計學意義（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表達低于敏感細胞（P=0.001），見圖3B。以上數據表明不同誘導方式導致耐藥細胞發生不同生物學變化，可能存在不同的耐藥機制。
2.4耐藥細胞的保存
耐藥細胞SKOV3/TAX30分別凍存在含有0、10、30nM紫杉醇的凍存液中，于凍存后1、3、6月復蘇，檢測IC50，見表3。1、3月后檢測結果提示，在3種藥物濃度條件下的細胞IC50沒有明顯區別，但凍存6月后，無藥凍存組的耐藥細胞與兩種加藥凍存組的細胞比較，其IC50明顯下降，差異有統計學意義（P<0.01）。同一個藥物濃度條件下，無藥凍存組的耐藥細胞在凍存6月時，出現耐藥性下降，而兩種加藥凍存組細胞在6月的凍存過程中，細胞IC50雖然出現輕度下降，但差異無統計學意義。
3、討論
3.1耐藥細胞的建立
本實驗結果提示：增加給藥劑量、適當延長無藥間歇期，可能延緩細胞的耐藥性。由于大劑量沖擊誘導與臨床治療模式相似，臨床上體內耐藥指數≥2倍即足以導致化療失敗[5]，因此大劑量沖擊誘導產生的耐藥細胞雖然耐藥指數較低，也是模擬臨床耐藥的良好模型。
3.2耐藥細胞的特性
本研究的結果表明：在無藥物作用時，SKOV3細胞的集落形成能力強于兩種耐藥細胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同濃度紫杉醇藥物條件下，耐藥性最強的SKOV3/TAX30集落形成能力也最強，而敏感細胞SKOV3的集落形成能力最弱，此結果與MTT法檢測的耐藥性一致。紫杉醇的作用機制是促進微管蛋白二聚體裝配成微管，抑制紡錘體形成，將細胞阻斷于G2/M期，細胞的有絲分裂異常或停止，使多核細胞的形成增多[6]。誘導的過程中耐藥細胞膨脹、形態不規則、細胞體積的增大可能與細胞群體中多核細胞的增多有關。本研究的生長曲線實驗中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增時間分別為28.9、24.0h，與敏感細胞SKOV3的倍增時間20.84h相比有明顯延長，顯示耐紫杉醇的卵巢癌細胞生長速度減慢。細胞周期的阻滯，除導致一些細胞周期特異性藥物失效外，腫瘤細胞處于相對靜止狀態，易對化療藥物產生耐受。
3.3耐藥相關基因的檢測
卵巢癌紫杉醇耐藥機制的研究中，多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）一直是熱點。多藥耐藥是指對一種藥物具有耐藥性的同時，也對其他結構和作用機制完全不同的化療藥物產生交叉耐受的一種現象。多藥耐藥的產生是一個多因素的過程，主要包括：（1）細胞內有效藥物濃度的降低；（2）細胞內藥物活性的改變；（3）凋亡的抑制；（4）腫瘤細胞微環境改變化療敏感度。P-gp是多藥耐藥基因MDR1編碼的相對分子質量為17kD的一種跨膜糖蛋白，其功能是使細胞內藥物濃度降低，藥物的作用減弱或喪失，細胞由此獲得耐藥性。與大多數其他化療藥物的多藥耐藥機制相似，紫杉醇作為P-gp的作用底物之一，其耐藥機制與MDR1基因擴增導致的P-gP高表達密切相關[7-8]。肺耐藥相關蛋白LRP是在多藥耐藥的肺癌細胞株中發現的與MDR相關的非糖蛋白，相對分子質量為110kD，能阻止藥物通過核孔進入細胞核，避免其作用于核內靶點，藥物運送到胞質的囊泡中，再通過胞吐作用將藥物排出體外，從而發生紫杉類藥物耐藥[9-10]。凋亡抑制基因也參于紫杉醇耐藥。BCL2L1基因，全稱為BCL-2樣1基因（BCL-2-like1）,編碼蛋白屬于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通過抑制腫瘤細胞凋亡，導致耐藥性[11-12]。PRKCA基因為蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被稱為PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。細胞過度增殖和抗細胞凋亡機制障礙都可導致腫瘤進展和耐藥現象發生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，當其表達增加或活性增強時，可使大量的P-gp磷酸化而活化，從而產生耐藥性。本研究結果提示。SKOV3/TAX300細胞PRKCA、LRP的表達均略高于敏感細胞。但SKOV3/TAX30細胞的PRKCA、LRP的表達與敏感細胞比較差異無統計學意義。BCL2L1在SKOV3/TAX30細胞的表達低于敏感細胞，但SKOV3/TAX300細胞中BCL2L1的表達略高于敏感細胞，結果提示不同方式誘導的耐藥細胞，可能存在不同的耐藥機制。
3.4耐藥細胞的保存
第2篇
1．1組織塊貼壁法分離培養hUC-MSCs臍帶取自正常分娩的新生兒(征得其父母同意)。首先用含雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗臍帶3次，去除雜物;用無菌的手術剪刀將臍帶剪成3～4cm的節段，再沿長度方向剪開，以暴露臍帶膠質部分，去除血管;置于含雙抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成約0．5cm3的組織塊，以膠質部分貼于基底平鋪于24孔板中，每孔2～3塊，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱孵育1～2h;待組織塊自然粘附于皿底部后加入含雙抗、FBS的低糖DMEM培養基，繼續置于培養箱內培養，每3d更換一次培養基，待觀察到有小三角形或梭形細胞從組織中鋪展出時，取出組織塊。整個分離過程注意無菌操作。待細胞生長至70%～80%匯合時，即可傳代。利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。取第5代細胞，采用細胞免疫熒光技術鑒定hUC-MSCs的表面標記物CD44。
1．2肝細胞標志基因的檢測按照總RNA提取試劑盒的操作說明分別提取hUC-MSCs和人肝癌細胞HepG2的總RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因組，最后檢測RNA的濃度和純度，立即進行反轉錄合成cDNA或保存于－80℃備用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR試劑盒反轉錄2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根據GenBank提供的人肝細胞標志基因序列，使用PrimerPremier5．0軟件設計引物，引物序列和產物大小見表1。GAPDH為內參對照。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30個循環;最后72℃延伸5min。PCR產物用20g/L的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠分析系統下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色試劑盒的說明書操作，對第5代hUC-MSCs和HepG2進行糖原染色，在倒置相差顯微鏡下觀察并照相。
2結果
2．1hUC-MSCs的分離、培養、傳代及鑒定組織塊貼壁培養3～4d時，可觀察到組織塊間隙鋪展出小三角形或長梭形的細胞，繼續培養至7d左右，可觀察到局部細胞呈集落生長，此時，在無菌條件下取出組織塊，更換新鮮培養基，繼續培養1周左右，細胞可達80%～90%匯合，即可傳代。用胰酶/EDTA消化后細胞呈亮而圓的單個分散狀，以1∶3的比例進行傳代，約4h貼壁，2d后迅速生長。倒置相差顯微鏡下可觀察到細胞較大，輪廓清楚，內部有清晰的應力纖維，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結構，細胞核呈規則的卵圓形，核仁大而明顯，呈典型的成纖維細胞樣形態(圖1A);持續培養大約2周時，細胞基本達到完全匯合，形態發生一定的變化，胞質變得狹窄，內部的應力纖維也不明顯，呈平行排列或漩渦生長(圖1B)。連續多次傳代，細胞保持穩定的、相對均一的成纖維細胞樣形態以及較強的增殖能力。經鑒定分離培養的細胞CD44呈陽性表達，且具有良好的均質性。
2．2肝細胞標志基因的表達以HepG2作為陽性對照，用RT-PCR檢測hUC-MSCs的肝細胞標志基因的表達情況，結果見圖2，hUC-MSCs表達ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表達TAT。
2．3PAS糖原染色結果對hUC-MSCs和HepG2進行PAS糖原染色，染色結果顯示兩種細胞的細胞質中均有紫色顆粒物形成，即均呈糖原陽性反應(圖3)。
3討論
MSCs能分泌多種細胞因子和生長因子，具有直接或間接的抗炎及抗纖維化作用，可抑制肝細胞的死亡和纖維化;還可通過其分泌物抑制肝細胞的凋亡、刺激肝細胞再生、為受損肝細胞提供營養支持等。MSCs還具有低免疫原性及免疫抑制力，適用于進行同種異體移植，在移植后可遷移、歸巢至受損的組織，發揮治療作用。因此，MSCs在肝臟疾病的細胞移植治療中具有廣闊的應用前景。研究發現，相較不同來源的MSCs，臍帶來源的MSCs不僅具有干細胞的特性，而且來源豐富、取材方便、增殖能力較強、無倫理法律限制，還具有較低的免疫原性和分化程度，從而成為一個非常有吸引力的移植治療肝病的細胞來源。
作者采用組織塊貼壁培養法從臍帶基質中分離獲得hUC-MSCs，與酶消化法和流式細胞儀或免疫磁珠分選法相比，該分離方法操作簡單，消耗低，易于控制。分離培養的hUC-MSCs呈典型的成纖維細胞樣形態，具有MSCs的表型特征，均質性良好，且在體外長期培養中能保持穩定狀態。進一步的RT-PCR結果顯示，培養的hUC-MSCs同時表達成熟肝細胞的標志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表達TAT，與Campard等的研究結果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝細胞的一些相關功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色結果則證明hUC-MSCs具有糖原合成和儲存能力。
第3篇
經濟的迅猛發展帶動科技的日新月異，網絡技術與通信技術發展迅速，微信、微博等交流媒介成為大眾知識共享的傳播平臺，而微課作為教學中的創新也備受關注，作為對傳統教學模式的顛覆，其更注重教學效率的提升與教學質量的理想化。伴隨移動學習時代的到來，微課使得當前學校教育及社會教育都發生了顯著的變化。但是我們應該看到，時代催生的網絡視頻也帶有某種弊端性，難以真實有效地滿足各個層面的學習需求[1]。焦建利教授提出：傳統的課堂實錄視頻資源已經難以實現互聯網時代人們注意力模式的匹配，因此傳統的教學方式也很難滿足師生教與學的需求。
加上網速及寬帶的硬性限制，教學資源周轉率低，優秀教育教學資源被無形浪費。基于這樣的背景，微課誕生，吸取了傳統教學視頻的弊端教訓，更注重主題的突出明確，更具有針對性與服務性，在內容設置上也趨于短小精悍，實現了自由補充與延伸[2]。對于生物細胞學科教學來說，實驗是教學的關鍵，在教學中發揮著重要的作用。不可否認的是生物學作為生命科學的前沿學科之一，無論是實驗技術方法還是理論知識闡述都實現了深度的提升與廣度的延伸，逐漸實現與遺傳學、分子生物學及發育生物學的學科融合，逐漸在生命科學研究領域占據主導[3]。因此，實現微課與細胞生物學實驗教學的結合，對學生創新能力與獨立思考能力的培養逐漸成為生物實驗教學關注的焦點，成為細胞生物學實驗教學改革的要務。
一、微課簡述
1.微課的起源。微課最早由美國愛荷華大學LeRoy A. McGrew教授提出，初衷是針對化學課程總結的60秒概述，設置了三大主體部分，分別為總體介紹、解釋說明及舉例分析。后來英國學者T.P.Kee在此基礎上提出了一分鐘演講，所謂的一分鐘演講就是突出演講的精練傳神，要求具有縝密的邏輯結構及真實生動的案例闡述。在經過上述兩個階段的發展后，微課由美國新墨西哥州圣湖安學院大衛.m.彭羅斯提出并創建實施。其包括15到30秒的介紹及結論，服務與上文的關鍵概念導引。然后錄制上述內容并限制時間為3分鐘內，在微課程指引下提出書面作業要求，學會借助課外閱讀或者實踐活動完成關鍵知識的學習。目前最具代表性的當屬Educause的微課理念，不是指微觀學習中的微內容，而是以建構主義學習理論為支撐的在線教學或格式化教學中的教學實際。
2.我國微課發展現狀。我國微課依然是新興事物，起步晚，發展相對緩慢，目前涉及領域也有部分處于空白。基于微課的發展現狀，當前學術界也未就微課理念達成共識。學者焦建利[4]認為，微課是對某一知識點的集中闡釋，主要特點就是短小精悍，在線教學視頻是其主要表現形式。學者祝智庭[5]則認為微課應該就某個教學主題展開延伸，組織精細化的課堂教學設計，時間限度最好控制在10分鐘以內。而學者胡鐵生[6]則認為微課程注重的是視頻的微小，因此在針對單一學科或者單一知識點組織教學時應注重教學情景的融入，突出在線學習與自由學習。這一概念也逐漸被大眾所認可。資源建設方面，我國微課也尚未成型，目前的應用研究還相對零散，評價模式也有待完善。實現微課程的規范化發展還有很長的路要走。
二、細胞生物學實驗教學存在的問題
1.內容更新緩慢，亟待加強。我國的細胞生物學實驗教學一直處于教學滯后階段，僅僅作為理論教學的補充或者教學附屬而開設，缺乏關注上必然影響教學的創新與跟進，加上該實驗教學項目單一化趨勢嚴重，時代氣息不足，技術手段及知識的綜合運用十分缺乏，內容更新十分滯后。
2.教學方式單一化，學生自主性不足。細胞生物學實驗的基本流程就是提前由教師準備好實驗材料、實驗儀器及實驗試劑，學生在教師的示范引導下按部就班地進行實驗操作，整個操作過程趨于程式化、簡單化。學生不僅無法在實驗準備階段有所參與，更挫傷了學生創新與研究的積極性。
3.教學方法貧乏，缺乏對學生創新能力培養的關注。傳統的細胞生物學實驗教學受有限的教學時間的限制，因此實驗內容與要求也大多提前限定，教師單純地演示講解，學生被動地參與學習，雙方互動交流不足，教師也無法引導學生進行實驗的創新。
4.教學技術陳舊，現代教育技術參與較少。細胞生物學作為生物教學的前沿學科，理應注重教學的創新，特別是積極加入現代教育技術的創新元素，以信息技術為核心推動實驗教學。但是我國細胞生物學的教學現狀卻是現代教育技術十分欠缺，傳統實驗教學維度單一化趨勢嚴重。
三、微課在細胞生物學實驗中如何應用
1.微課的特性和優勢，傳統多媒體教學的弊端：伴隨多媒體技術的迅猛發展及教學融入，部分教師開始嘗試運用多媒體輔助教學，但是當代大學生自由散漫的個性也成為多媒體輔助教學實施的制約因素，學生難以集中精力聽取教師講課，精品的視頻資源難以得到高效率的運用。應用于課后學習的視頻資料也難以受到學生的關注與重視，多數處于閑置。微課則突破了視頻教學的局限，具有普通視頻教學資源不具備的教學優勢。首先，其教學內容濃縮，教學時間較短，借助移動端操作更為便捷，學生學習積極性顯著提升。其次，其教學主題十分明確，學生能夠迅速找到自己感興趣的點，從而獲得啟發教育或者延伸學習。最后，微課視頻的教學容量相對較小，符合學生的接受能力，學生更積極主動地參與到微課學習中去。
2.細胞生物學微課設計，把握10分鐘原則：注意力10分鐘。10分鐘內有明確的教學目標，內容短小，集中說明一個問題的小課程。微課設計ADDIE模型：A，分析;D，設計;D制作;I應用;E，評價。通常來說，微課設計要想保證自身的完整性必須具備6個基本環節，分別為教學主題的明確、前段分析、微課基礎知識點的切割與劃分、微課資源要素的重點設計、微課視頻錄制及后期加工處理、微課的最終終端輸出與展現。6個環節緊緊相扣，推動微課的高效開展。
四、微課引入實驗教學的意義與應用前景
微課具有廣闊的教育應用前景。2011年，手機將取代個人電腦成為個人信息中心。學生自帶設備BYOD，包括個人電腦、手機、上網本、平板等越來越普遍化。這為微課的實施提供了必備的硬件前提。調查中發現，84.44%的被調查者認可微視頻在微課教學中的核心地位與作用，并且70%以上的人認為配套的教學設計與課件也是不可忽視的部分。縱觀當前的教育改革，多數一線教師已經充分認識到微課教學的魅力與優勢，開始在課堂教學中嘗試微課教學。其中范福蘭等人在基于交互式微視頻教學資源教學應用效果的調查顯示，70.5%的學生認為交互式微視頻資源能夠激發他們對課程學習的興趣，單一的圖文及音視頻資源則受關注度一般，這也從側面說明隨著流媒體技術的發展成熟，微視頻的教學前景將是廣闊而光明的。
五、一些值得思考的問題
1.有關微課適用性，微課程在全國范圍內展開，帶來教學思想、教學模式的重大轉變，各個領域、各種培訓、不同學科對于微課程應用的嘗試存在“泛用”、“濫用”現象。微課程適用于哪些領域、哪些課程、哪些內容以及熒光怎樣設計、怎樣制作、怎樣使用才是最科學合理的成為今后科學研究的新課題。
2.細胞生物學實驗微課應用存在問題，我國針對該專業的微課理論研究及實踐演練依然不足，多數高校在微課開展實施的過程中存在建多用少的資源浪費現象。因此必須將微課作為校本研修資源，對其加強引導宣傳，讓教師認可微視頻教學的優勢并拓展專業發展的新途徑。此外微課程應奠定創新型教學模式的資源基礎，以期為學生提供更實用的教學資源，做好教學輔助。當然微課作為新興教學理念，應該在移動學習與泛在學習的基礎上實現教學需求與教學實踐的同步發展，最大限度提升微課程的開展利用率。
六、總結
微課作為新興的教學模式理應受到關注，了解微課的本質內涵，在梳理其優勢與缺陷基礎上綜合當前的運用實際，科學預測并規劃后期發展，實現微課在設計開發與應用上的創新完善。本文就微課教學的幾點問題進行了歸納分析，以期為微課教學的拓展應用提供有效思路，讓微課的魅力更多地展現出來，服務于高校教學。
