石榴葉多酚的抗氧化活性研究范文

本站小編為你精心準備了石榴葉多酚的抗氧化活性研究參考范文，愿這些范文能點燃您思維的火花，激發您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《南京師大學報》2015年第五期

石榴（PunicagranatumL.）別名安石榴、海榴、單若、金罌、天漿等，是石榴科石榴屬植物，為落葉灌木，在我國分布廣泛，目前全國石榴栽植面積達64668hm2，居世界第一位［1］.石榴的葉子具有收斂止瀉、殺蟲、治療痘風瘡、癩瘡、跌打損傷等一系列功效.雖然石榴葉具有多種生理功能，但其利用率不高，大多數的石榴葉都作為農業垃圾處理，造成資源的浪費［2-4］.據報道石榴中含有豐富的安石榴苷、沒食子酸、鞣花酸、短葉蘇木酚等多酚類化合物［5-8］.該多酚類化合物在抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調節血脂等方面都顯示了巨大的藥用價值和潛力［9-12］.但是目前對石榴葉粗多酚（crudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves，CPPL）的純化研究較少.本研究通過吸附、解吸實驗考察了大孔樹脂對CPPL的純化效果，并對其分離純化工藝進行優化，進一步比較了CPPL、石榴葉多酚1（purifiedpolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves1，PPPL1）與石榴葉多酚2（purifiedpolyphenolsofcrudepolyphenolsfromPunicagranatumL.leaves2，PPPL2）的抗氧化性.以期為提高石榴葉的經濟利用價值提供一定的實驗依據.

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料石榴（PunicagranatumL.）葉采于江蘇省南京市鼓樓區，洗凈烘干，經粉碎機粉碎后，過60目篩，避光保存備用.大孔樹脂AB-8、聚酰胺購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司.

1.1.2試劑乙醇、鹽酸、無水碳酸鈉購自南京創化化玻儀器有限公司；沒食子酸標準品購自美國Sigma公司；Folin-酚試劑購自南京榮世德貿易有限公司；蘆丁（Rutin）標準品由中國藥品生物制品檢定所提供.

1.1.3儀器高速萬能粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉蒸發器購自上海亞榮生化儀器廠；循環水真空泵購自南京科爾儀器設備有限公司；JY92-II超聲波細胞破碎器購自寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-22M高速冷凍離心機購自湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司；722可見分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司；恒溫水浴鍋購自金壇市杰瑞爾電器有限公司.

1.2石榴葉多酚制備的方法

1.2.1石榴葉多酚的制備CPPL：準確稱取2g粉末樣品，以20∶1液料比加入50%的乙醇水溶液，超聲破碎后，調節pH為2，置水浴鍋水浴1.5h，5000r/min離心10min后過濾，取一定量的濾液用Folin-Ciocalteu法測定吸光度，計算多酚濃度［13］.PPPL1：將上述CPPL旋轉蒸發后冷凍干燥，過AB-8得到PPPL1.PPPL2：按文獻［14］的方法將上述PPPL1過聚酰胺得到PPPL2.

1.2.2石榴葉總酚含量的測定沒食子酸標準曲線的繪制：分別吸取100mg/L沒食子酸備用液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL于試管中，依次加入80%乙醇溶液補充至1mL，得到0mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L的沒食子酸標準系列.取0.2mL標準液于試管中，分別加入2mL0.5mol/LFolin-酚試劑，混勻后在室溫下靜置4min，然后用2mL飽和碳酸鈉中和，室溫條件下在暗處放置2h后用分光光度計在760nm波長下測定吸光度.以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為：y=0.0068x+0.0194，R2=0.9954.石榴葉總酚含量的測定：取一定濃度的樣品溶液0.2mL，后續步驟同標準溶液測定方法，根據標準曲線求得其濃度，并計算出總酚含量.

1.3石榴葉多酚純化的工藝條件

1.3.1大孔樹脂的預處理將樹脂用無水乙醇室溫下密封浸泡8h，水洗至無醇味，用5%鹽酸溶液浸泡8h，水洗至中性，再用5%NaOH液浸泡8h，水洗至中性，加水備用.

1.3.2大孔樹脂靜態吸附及解吸附動力學曲線的繪制稱取抽干大孔吸附樹脂2g，分別裝入具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的提取溶液50mL，置于振蕩器中（25℃，180r/min）靜態吸附12h.期間每隔一定時間用注射器吸取少量溶液，測定其多酚濃度，繪制靜態吸附動力學曲線.將充分吸附后的樹脂2g用蒸餾水清洗至樹脂表面無提取溶液殘留，濾紙吸干樹脂表面殘留的溶液，然后置于具塞三角瓶中，加入50mL95%乙醇，于相同條件下解吸6h，期間每隔一定時間用注射器吸取少量溶液，充分解吸后取上清測定總多酚的濃度，再按如下的公式計算吸附量、吸附率和解吸量，繪制靜態解吸附動力學曲線。

1.3.3靜態吸附與解吸條件的優化分別考察提取液多酚質量濃度、提取液pH值、上樣流速對樹脂吸附的影響，考察乙醇體積分數及洗脫劑用量對樹脂解吸的影響.

1.4石榴葉多酚的抗氧化活性

1.4.1亞硝酸鹽的清除參照王樹慶等的方法并有所改動.分別在試管中加入1mL一定梯度的樣品溶液，再分別加入5mL一定濃度的NaNO2溶液，37℃恒溫水浴30min，隨后加入1mL0.4%對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置15min后加入0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水3.5mL，混勻，靜置15min，最后于538nm波長處測定吸光值，亞硝酸鹽清除率計算如下。

1.4.2還原力的測定參照Seordino等的方法并有所改動.在2.5mLpH=6.6的磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的樣品溶液1mL，并加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合，50℃恒溫水浴20min，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，5000rpm離心10min，取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1%FeCl3溶液0.5mL，混勻后靜置10min，在700nm處測定吸光值，以50%的乙醇溶液為空白對照.

1.4.3超氧陰離子自由基的清除采用鄰苯三酚法，取pH8.2的磷酸緩沖液3mL，分別加入一定體積的樣品溶液，并使用去離子水使反應體系補至9mL，混勻，25℃水浴平衡20min.然后加0.6mL7mmol/L的鄰苯三酚，混勻，立即放入分光光度計中，測定325nm處的吸光值，記錄反應5min后的結果（測各樣品時，以去離子水代替鄰苯三酚作為空白管）.超氧陰離子自由基的清除計算公式如下。

1.4.4羥自由基的清除采用改良的水楊酸法［29］，分別取1mL不同濃度的多酚或者蘆丁溶液，加入1mL9mmol/LFeSO4，1mL9mmol/L水楊酸-乙酸溶液，最后加入1mL8.8mmol/LH2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水為空白對照，考慮到多酚本身的吸光度值，以加入1mL蒸餾水代替H2O2的反應液作為多酚的本底吸收值，在510nm處測量各濃度的吸光度.

2結果與分析

2.1石榴葉多酚純化工藝2.1.1AB-8樹脂吸附及解吸附石榴葉多酚的動力學特性曲線由圖1AB-8吸附動力學可知，0min~200min內，隨著吸附時間的增加，AB-8樹脂吸附多酚量增加，200min后已經基本達到吸附飽和，說明AB-8樹脂屬于快速平衡型樹脂.由圖2解吸動力學曲線可知，在80min左右時，已經達到了最大解吸量.以上實驗結果表明，AB-8樹脂能快速地達到吸附平衡和解吸平衡，是富集和洗脫CPPL的理想樹脂.

2.1.2多酚濃度對吸附量的影響由圖3可知，CPPL濃度在0.2mg/mL~2.0mg/mL之間，樹脂的多酚吸附量隨著濃度的增加而迅速增加，濃度為2.0mg/mL~3.5mg/mL時，吸附量隨濃度增加變化緩慢.由此可得出，提高上樣濃度雖然有利于提高樹脂的使用效率，但是上樣濃度過高時，上樣液易出現絮凝現象，造成樹脂堵塞，反而降低其吸附能力，因此選定上樣液粗提物濃度為2.5mg/mL較為合適.

2.1.3pH對吸附量的影響由圖4可知，AB-8對CPPL的吸附量先升高后下降，在pH=4時吸附率達到最大，pH=7時吸附率最低，其原因可能是上樣液pH的變化可以改變目標成分在溶液中存在的形式，影響其溶度，從而影響目標成分與大孔吸附樹脂的分子間作用力.多酚類化合物呈酸性，在微酸性條件下吸附效果較好，因此選pH=4為宜.

2.1.4上樣流速對吸附效果的影響以流出液累積體積為橫坐標，流出液濃度為縱坐標作圖，由圖5可知，上樣流速分別為1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min時，泄漏點分別出現在160mL、130mL、100mL、90mL附近，流速為1mL/min時，雖然泄漏點出現的最遲，但因為流速慢，導致生產周期過長、多酚被氧化.綜合考慮后，選擇上樣流速為2mL/min.

2.1.5乙醇濃度對樹脂解吸的影響由圖6可以看出，隨著乙醇體積分數的升高，解吸率先上升后有下降趨勢，在40%~60%之間時，解吸率上升幅度較快，當乙醇體積分數為60%時開始下降.因此，從節約資源的角度考慮選用60%乙醇溶液對CPPL進行洗脫.2.1.6洗脫劑用量的確定由圖7可知洗脫曲線呈高斯分布，表明AB-8樹脂對CPPL有很好的洗脫能力.樹脂上吸附的多酚類物質易洗脫，洗脫峰比較集中，當洗脫體積為40mL~60mL時，洗脫液中的多酚含量最高.洗脫劑用量為80mL即1.7BV，CPPL基本被完全洗脫，在此基礎上，再增加洗脫劑用量，解吸量雖有所增加，但增幅很小.因此，從節約成本出發，宜以1.7BV~2.0BV左右的洗脫劑用量進行洗脫.

2.2石榴葉多酚的抗氧化活性

2.2.1對亞硝酸鹽的清除作用由圖8可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均對亞硝酸鹽有較好的清除效果，且隨濃度的增大清除率也隨之增大.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：307.42mg/L、133.95mg/L、102.94mg/L及227.00mg/L.結果表明：PPPL1和PPPL2對亞硝酸鹽的清除作用明顯好于Rutin及CPPL，且在相同濃度下PPPL2的清除效果也明顯好于PPPL1.提示隨著石榴葉多酚純度的提高其清除亞硝酸鹽的能力也會增強.

2.2.2還原力的測定由圖9可知，在試驗濃度范圍內，石榴葉多酚的還原能力與濃度呈一定的量效關系，還原能力隨多酚的質量濃度增加而增強.相同濃度下，4種樣品的還原力為：PPPL2>PPPL1>Rutin>CPPL.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：94.78mg/L、56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.說明純化有利于提高石榴葉多酚的還原能力，通過純化后的石榴葉多酚的還原力強于Rutin.

2.2.3對超氧陰離子自由基的清除作用由圖10可知，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin均對超氧陰離子有較好的清除效果，且隨濃度增大清除率也增大，4種樣品對超氧陰離子的清除能力順序為：Rutin>PPL2>PPL1>CPPL，CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：441.27mg/L、369.70mg/L、255.15mg/L、59.78mg/L.表明石榴葉多酚對超氧陰離子有一定的清除作用，且經分離純化后對超氧自由基的清除作用得到增強.

2.2.4對羥自由基的清除作用由圖11可知，在0mg/L~25mg/L范圍內石榴葉多酚及Rutin對羥自由基的清除率呈現一定的量效關系.PPPL2在0mg/L~5mg/L時就顯示出較強的清除效果，而CPPL在此濃度范圍內則幾乎沒有對羥自由基起到清除的效果；當濃度達到25mg/L時，PPPL2、PPPL1及Rutin對羥自由基的清除率并沒有明顯的差異.CPPL、PPPL1、PPPL2及Rutin的IC50分別為：22.25mg/L、14.89mg/L、13.07mg/L、9.15mg/L.表明隨著純度的提高，清除羥自由基的效果越好，說明石榴葉多酚經純化后其生物活性能更好地發揮出來.

3討論

自由基是人體內普遍存在的一類物質，主要包括超氧陰離子（O2-•）、羥自由基（•OH）等氧自由基和氮自由基.正常情況下，體內存在的防御系統能夠有效清除多余的自由基.但是生活中大氣污染、輻射、吸煙和營養過剩等問題極易使人體內自由基增多，從而導致氧化損傷，這將直接或間接地引起蛋白質變性、生物膜結構損傷等一系列病變，嚴重的可造成死亡［30］.另外當人體攝入硝酸鹽和可亞硝基化的胺類后會在體內形成N-亞硝胺，只有在體內阻斷亞硝胺的前體，才能有效防治癌癥.天然抗氧化劑如多酚類、多糖類、維生素等被廣泛運用到食品和化妝品中幫助清除自由基，起到抗氧化作用，并阻斷亞酸胺合成的作用，保障人體健康.因此研究天然高效低毒的抗氧化劑已成為當今研究的熱點，近些年人們已由原來研究人工合成抗氧化劑轉移到研究從天然植物中篩選抗氧化成分上.本實驗得出石榴葉多酚純化的最佳工藝條件為：AB-8的最佳飽和吸附及解吸時間為200min和80min，上柱質量濃度2.5mg/mL，pH為4，上柱速率2mL/min.由動態解吸附試驗又得到最適AB-8的解吸條件為：乙醇體積分數60%，洗脫量1.7BV~2.0BV.在此條件下，CPPL的純度由39.67%提高到62.44%，并采用聚酰胺樹脂對PPPL1進行分離，得到了純度為92.83%的PPPL2.研究石榴葉多酚的抗氧化作用，得出其對超氧自由基、羥自由基、亞硝酸鹽的清除率以及還原能力隨著樣品濃度的增加和純度的提高不斷上升.其中PPPL1、PPPL2及Rutin對亞硝酸鹽的半抑制率分別為：133.95mg/L、102.94mg/L、227.00mg/L，還原力的IC50值分別為56.93mg/L、30.77mg/L、77.32mg/L.由此可以看出PPPL1和PPPL2在還原力及清除亞硝酸鹽能力上比Rutin具有更強的抗氧化效果.因此進一步探究提高石榴葉多酚純度的方法和石榴葉多酚抗氧化活性方面的研究將對石榴葉作為天然抗氧化劑的開發具有重要意義.

作者：邢佳 陸文娟 趙云霞 陶明煊 單位：南京師范大學金陵女子學院