瀕危植物珙桐種群遺傳多樣性分析范文

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《西南大學學報》2015年第三期

珙桐DavidiainvolucrateBaill．系珙桐科珙桐屬落葉喬木，中國特有的單型屬植物，天然分布在我國的7個省，即貴州、湖北、湖南、陜西、四川、云南及甘肅［1］．珙桐科僅一種一變種，即珙桐和光葉珙桐DavidiainvolucrateBaill．var．vilmoriniana．它們起源古老，是第三紀古熱帶植物的孑遺樹種，屬國家一級保護植物．珙桐具有極高的觀賞價值，是世界上公認的著名觀賞樹種，開花時因其棕紅色頭狀花序和潔白的苞片酷似展翅的白鴿，故有“中國鴿子樹”的美稱．自珙桐被人們發現之后，被國內外大量引種，目前的分布已遠遠跨越其天然保存的范圍，而且引種的趨勢是逐漸北移和海拔越來越低．但由于人為破壞和環境因素的影響，天然珙桐的種群數量和分布范圍都在縮小，張清華等［8］認為到2030年，適宜珙桐分布的面積比當前氣候條件下適宜珙桐分布的面積約減少20％．珙桐瀕危的原因是多方面的，包括生境范圍狹窄、自然更新困難、種子敗育嚴重、人為砍伐破壞及挖掘野生苗等［9］．因此，加強珙桐的保護和研究，合理地開發和利用具有重要的意義．我國從20世紀70年代開始對珙桐進行研究，主要集中在珙桐群落學、地植物學、人工繁殖技術及引種栽培、種群生態學、生物學特性、組織培養技術、形態解剖學等方面．進入21世紀以來，對珙桐的研究有了一定的進展，主要集中在生理、生化、繁育及分子生物學等方面，但利用分子標記對不同種群珙桐的遺傳多樣性研究還是相對缺乏．本文利用ISSR技術對分布于貴州省內的3個珙桐自然種群、2個珙桐人工種群、1個光葉珙桐人工種群及分布在湖北省內的1個珙桐人工種群的遺傳多樣性、種群內和種群間的遺傳變異進行分析，旨在揭示珙桐種群的遺傳多樣性和遺傳背景，為瀕危植物珙桐的保護和合理開發利用奠定基礎．

1材料與方法

1．1供試材料供試材料選取珙桐的6個種群和光葉珙桐的1個種群，取其新鮮幼嫩的葉片放在自封袋中，用冰盒帶回實驗室置于－80℃冰箱中保存．樣品的來源及編號見表1．

1．2方法

1．2．1珙桐DNA的提取選用幼嫩葉片，參照改良的CTAB法［22］提取珙桐基因組DNA，DNA濃度和純度用紫外分光光度計檢測，波長260～280nm，OD值在1．8～1．9之間，所提取的DNA純度較高，可用于ISSR擴增反應．

1．2．2ISSR擴增反應ISSR擴增反應的引物參照哥倫比亞大學公布的引物序列，由北京賽百盛公司合成，在Bio－Rad梯度PCR擴增儀中擴增．ISSR擴增反應20μL體系中進行，反應體系如下：模板40ng、1．0UTaq酶、10×buffer2．0μL、ISSR引物（10μmol／L）1．2μL、dNTP（2．5mmol／L）2．1μL、MgCl2（25mmol／L）1．8μL、雙蒸水補足至20μL．PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，43．8～57℃（不同引物退火溫度不同）退火45s，72℃延伸1min，40個循環；72℃延伸7min．PCR產物在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，凝膠中含有0．05％的溴化乙錠，以100bpMarkerDNA作為標準相對分子質量對照，在凝膠成像系統上觀察并拍照記錄．

1．2．3數據統計ISSR為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性．電泳圖譜中的每一條帶均視為一個分子標記，代表一個引物的結合位點．對凝膠上的帶進行統計，按清晰易變、重復穩定的原則讀帶，有帶或弱帶記為1，無帶的記為0，獲得二元數據矩陣．用POPGENE軟件進行數據處理，計算各群體間和群體內的遺傳參數．根據Neis遺傳距離，按不加權成對算術平均法（UPGMA）建立系統聚類分支樹狀圖．為了檢測群體間遺傳距離和地理距離的相關性，運用TFPGA程序進行了Mantel測試．

2結果與分析

2．1ISSR遺傳多樣性分析從100條引物中篩選出12條能產生條帶清晰、重復性好的ISSR引物，對7個群體的117個個體進行擴增，共產生199條條帶（表2）．圖1顯示引物UBC881對貴州佛頂山（FDS）的擴增結果．在199條條帶中，有177條具有多態性，多態百分率為（PPL）88．94％．每條引物平均產生16．58條條帶，多態性百分率為85．0％～100％（表2），說明珙桐具有相對高的多態性．表3顯示了不同群體的遺傳多樣性結果，在7個種群中，佛頂山（FDS）、梵凈山（FJS）、湖北（HB）、寬闊水（KK）、林科院（LKY）、納雍（NY）、植物園（ZWY）的多態百分率分別是39．20％，47．74％，40．70％，36．18％，48．74％，35．18％，35．68％，其中林科院（LKY）的多態百分率最高，而納雍（NY）的多態百分率最低．Neis遺傳多樣性（He）在0．1260～0．1795之間，平均為0．1467．從表3還可以看出，各群體的Shannons信息指數（Ho）與多態百分率（PPL）和Neis遺傳多樣性（He）的大小變化趨勢基本一致，即PPL高的群體其He和Ho也高．此外，還分析了物種水平的遺傳多樣性，在物種水平上PPL為88．94％，Ao，Ae，He和Ho分別為1．8894，1．4813，0．2784和0．4187．

2．2群體間的遺傳變異分析POPGENE軟件的分析結果顯示，珙桐群體間存在一定的遺傳分化．7個群體間總的遺傳多樣性（Ht）為0．2793，而群體內的遺傳多樣性（Hs）為0．1468．根據總的遺傳多樣性（Ht）和群體內遺傳多樣性（Hs）計算不同群體間的分化水平（Gst），所分析的7個珙桐群體間Gst為0．4745，表明總的遺傳變異中有47．45％的變異存在于群體間，群體內的遺傳變異為52．55％．群體間每代個體的基因流（Nm）為0．5537．

2．3群體間的聚類分析計算Neis遺傳一致度（I）和遺傳距離（D）（表4），從表4中可見I值的變化范圍為0．7690～0．8681，平均為0．8191；D值變化范圍為0．1415～0．2626，平均為0．2003．其中LKY與FJS的遺傳一致度（I）最高，ZWY與FDS的遺傳一致度最低．利用UPGMA法構建群體遺傳關系聚類圖（圖2），以0．26為閾值，7個群體分為2支．FDS的單獨一支，其余6個聚為一支，表明佛頂山的群體與其余群體的親緣關系較遠．從圖2中還可看出，FJS，ZWY和LKY聚在一起，表明這幾個群體的親緣關系相對較近．Mantel測試表明，群體間的遺傳距離與地理距離之間沒有顯著的正相關性（r＝0．1090，p＝0．5930），說明珙桐的遺傳變異沒有明顯的地域趨勢．

3討論

3．1珙桐的遺傳多樣性采用ISSR分子標記技術，對瀕危植物珙桐的6個種群和1個光葉珙桐種群進行分析，結果表明珙桐具有豐富的遺傳多樣性．Hamrick等［26］研究了220個屬662個種林木中的物種遺傳多樣性平均水平（P＝64．7％，H＝0．257）．王靜等［27］研究了瀕危植物連香樹的遺傳多樣性水平（P＝69．59％，H＝0．2313，I＝0．3514）．葛永奇等［28］研究了孑遺植物銀杏的遺傳多樣性水平（P＝70．45％，H＝0．3599）．與珙桐7個種群的遺傳多樣性水平（P＝88．94％，H＝0．2784，I＝0．4187）相比，珙桐具有很高的遺傳多樣性水平．瀕危植物珙桐在數百萬年以前，曾在地球上廣泛分布，經過第四紀冰川的影響，只在我國西南地區幸存下來．珙桐遺傳多樣性豐富的原因可能與幸存個體保留了其祖先豐富的遺傳基礎有關，使其現存物種具有較高水平的遺傳多樣性．

3．2珙桐群體的遺傳結構群體的遺傳結構是通過物種群體間和群體內的遺傳分化來體現［29］．本研究得出珙桐種群間遺傳分化參數即Neis種群間遺傳分化系數（Gst）為0．4745，表明有47．45％的遺傳變異存在于種群間，而種群內的遺傳變異占總變異的52．55％，表明其種群間發生了較大程度的遺傳分化．影響自然群體遺傳分化的原因有多種，包括植物的繁育體系、基因突變、種子傳播機制、自然環境的選擇作用和基因流等．珙桐7個種群的基因流（Nm）僅為0．5537．Slatkin認為［30］，當Nm＜1時基因流就不足以抵制種群內因遺傳漂變而引起的種群分化．由傳粉和種子傳播產生的基因流是導致種群內遺傳分化的主要因素之一［31］．珙桐的基因流主要是通過蟲媒傳粉和果實遷移來實現的，珙桐基因流不足的原因可能與種子的生物學特性有關．珙桐的果實為核果，呈長橢圓形，具有肉質的果皮，內果皮骨質，表面有深溝，十分堅硬，不易萌發，種子的散布局限在樹體1～10m環帶附近［32］；種子休眠期長，敗育現象嚴重且具有生理后熟期［16］等，這些原因阻礙了珙桐的自然更新，使種群難以擴張，同時也造成了珙桐群體間較低的基因流動．

3．3珙桐的保護策略珙桐是中國特有的珍稀瀕危樹種，具有極高的觀賞價值、生態價值和科研價值．由于生境范圍狹小、自然更新困難、種子敗育現象嚴重和人們的肆意破壞等原因，珙桐的自然種群數量急劇減少．本研究表明珙桐具有豐富的遺傳多樣性，且種群內的遺傳變異大于種群間的遺傳變異．為了有效保護珙桐的遺傳多樣性，建議加強珙桐原產地的就地保護，同時人為推廣種子繁殖的方式，達到盡可能保護珙桐豐富的遺傳多樣性的目的．

作者：關萍 張玉晶 石建明 陳業 單位：貴州大學 生命科學學院