轉染基因對同種大鼠皮膚移植的影響范文

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【摘要】目的構建攜帶免疫調節因子vIL-10cDNA的真核表達載體，轉染骨髓基質干細胞。篩選后對大鼠進行腹腔種植，4周后移植同種異體全層皮膚，觀察大鼠對異體皮膚的免疫排斥反應。方法PCR擴增原核載體PET-28α/vIL-10，獲得目的基因vIL-10，目的基因在大腸桿菌中擴增后連入真核表達載體pcDNA3.1(+)，轉染大鼠骨髓基質干細胞。用G418篩選得到vIL-10高表達的細胞，腹腔種植于大鼠體內，對照組為未轉染的骨髓基＋質干細胞。四周后異體植皮，7d后拆線、觀察皮膚生長情況并采血使用流式細胞學技術分析外周血中CD3、＋＋CD4、CD8細胞百分數。結果vIL-10cDNA真核表達載體成功轉染并表達于骨髓基質干細胞；同種異體植皮一周后應用vIL-10cDNA真核表達載體可以提高大鼠移植皮膚的存活質量；通過流式細胞儀對淋巴細胞亞型分析++++結果顯示，應用vIL-10cDNA真核表達載體的大鼠血液中CD3/CD4絕對數值、CD4/CD8的比值均比對照組和空白組高。結論轉染vIL-10基因可以降低大鼠全層皮膚移植后的免疫排斥反應。

【關鍵詞】病毒白細胞介素-10；骨髓基質干細胞；免疫排斥反應；皮膚移植

既往研究表明，異體皮膚移植有望成為解決燒傷病人皮源不足問題的有效方法，但異體間的免疫排斥反應一直是現在醫學難以跨越的鴻溝。vIL-10被認為是一種抑制同種異體移植免疫排斥反應的較理想細胞候選因子，而骨髓基質干細胞（MSCs）可以在體內微環境的誘導下分化為成纖維細胞和角朊細胞，且因其具有來源可靠、體外易擴增及不涉及倫理問題等優點成為首選種子細胞。異體移植的成功與否主要取決于個體間的免疫排斥反應的大小，我們通過構建vIL-10的真核表達載體，轉染骨髓基質干細胞，植入大鼠體內，觀察vIL-10在MSCs中的高表達對異體移植間的免疫排斥反應有無抑制作用。

1材料與方法

1.1材料

成年Wistar大鼠購自山東省實驗動物中心。DH-5α大腸桿菌菌株和表達載體pcDNA3.1(+)均由濰坊醫學院免疫學教研室梁淑娟博士惠贈。PET-28α/vIL-10質粒由福州總醫院實驗科吳玉水博士惠贈。脂質體轉染試劑Lipofectamine2000、G418sulfate、DNA限制性內切酶和DNA連接酶分別購自美國invitrogen公司、加拿大BBI公司及MBI公司，UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、UNIQ-10柱式膠回收試劑盒、UNIQ-10柱式質粒少量抽提試劑盒、AMVsinglestepRT-PCRkit均購自上海生物工程公司。Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-ratCD3、Phycoerythrin（PE）anti-ratCD8a、PEanti-ratCD4均購自BD公司。

1.2真核表達載體pcDNA3.1(+)/vIL-10的構建和純化

根據Genbank提供的EB病毒基因組DNA中編碼的vIL-10的BCRF1基因序列，PrimerPremier5.0軟件設計針對該序列的上下游引物。對引物分別引入EcoRI、XhoI酶切位點及保護堿基，同時在上游引物引入起始密碼子以提高目的基因與質粒表達載體連接的效率，上游引物命名為P1（5'-CGGAATTCATGGAGCGAAGGTTAGTG-3'），下游引物命名為P2（5'-CGCTCGAGTCACCTGGCTTTAATTGT-3'），通過PCR法擴增目的基因，經EcoRI、XhoI酶切回收目的基因片段并與pcDNA3.1(+)酶切載體連接，連接產物轉化感受態DH-5α大腸桿菌，菌落PCR鑒定、質粒抽提pcDNA3.1(+)/vIL-10后酶切、測序鑒定，得到正確連接的重組體。

1.3MSCs體外分離和培養

將大鼠脫頸處死后置于75%酒精中浸泡10min，無菌條件下分離出股骨和脛骨。用DMEM培養基反復沖洗大鼠骨髓腔，將骨髓液吹打制成單細胞懸液并通過200目不銹鋼濾網過濾，1500rpm離心5min，52以4×10/cm接種于DMEM培養基（含10%胎牛血清）中，置于37℃、5%CO、飽和濕度恒溫培養箱2中培養，隔天換液，待10-14d細胞生長融合成片后，傳代培養。

1.4vIL-10高表達細胞的篩選

按照LF2000脂質載體轉染試劑盒說明，高純度的真核表達載體pcDNA3.1(+)/vIL-10轉染生長良好的第二代MSCs，在濃度不斷升高的含G418的培養基中生長，最終得到能抵抗G418濃度為300㎎/L的細胞，分別命名為G418-100、G418-200、G418-300。

1.5轉化細胞中vIL-10的表達

UNIQ-10柱式骨髓基質干細胞的總RNA抽提以未轉染的骨髓基質干細胞為對照，收集轉染組與對6照組各約1×10個細胞，加入350μlRLTSolution，震蕩裂解，收集細胞總RNA。將得到的RNA在微量核酸定量儀上測定OD和OD值，計算OD/OD比260280260280值，分析總RNA純度。取10μl作為模板RNA，通過RT-PCR法擴增目的基因，反應結束后取5μl樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6動物模型實驗

取20只Wistar純種大白鼠，體重200-260g，鼠齡3-5個月，隨機分為三組：實驗組（A）、陰性對照組（B）、空白對照組（C）。胰酶消化G418篩選后的高表達骨髓基質干細胞，PBS洗滌3次，42PBS重懸，得到6×10/cm的細胞懸液；按1ml/只腹腔注射于實驗組大白鼠，陰性對照組注射等量未轉染的骨髓基質干細胞懸液，空白對照組注射等量生理鹽水。合籠飼養4周。異體植皮取A、B、C組Wistar大鼠各一只做為供皮組，腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g），取皮備用。同法麻醉其他實驗組大鼠，剪除背毛，消毒局部皮膚，成品字形在背部做三個直徑約1.2cm的圓形全層皮膚缺損。在缺損處分別植入A、B、C供皮組皮膚，打包加壓縫合。同法處理對照組和空白組大鼠。

2結果

2.1重組載體pcDNA3.1(+)/vIL-10的構建及鑒定

以原核質粒PET-28a/vIL-10為模板，利用pfuDNA聚合酶的高保真性能，擴增vIL-10基因。產物回收純化后，經EcoRI和XhoI限制性酶切，獲得目的基因片段，同時對pcDNA3.1(+)進行EcoRI和XhoI限制性酶切，獲得表達載體大片段，純化的目的基因酶切片段和表達載體酶切片段，按照3~5：1比例進行連接構建后，轉化DH-5α感受態菌株，挑取單個陽性菌落，單菌落培養后，進行菌落PCR鑒定（圖1），PCR陽性者進行小量質粒抽提后，再利用EcoRI和XhoI進行限制性酶切鑒定，可見切出一大小約510bp的目的基因片段，與預期片段大小符合。最后將重組質粒做DNA序列分析，確認獲得pcDNA3.1(+)/vIL-10真核表達載體。2018年第24卷第6期高學軍等轉染vIL-10基因對同種大鼠全層皮膚移植的影響•633•

2.2MSCs的體外培養

接種24h后可見成纖維狀細胞以散在方式貼壁生長，多數為梭形的成纖維狀細胞，也可見一些圓形的內皮樣細胞，傳代后細胞基本呈均勻性生長（圖2）。

2.3總RNA抽提和目的

基因RT-PCR擴增結果（圖3，4）

2.4異體植皮（圖5）

2.5植皮一周后大體觀察（圖6)

全部實驗動物在術后均未發生感染、體液滲出等不良反應。傷口包扎對動物的活動亦無明顯影響。攝食、飲水，排便情況正常，均成活至完成實驗。實驗組移植皮膚與正常皮膚邊界相互融合，顏色比正常皮膚紅潤，移植皮膚與創面黏附較好；對照組和空白組移植皮膚有少部分與正常皮膚邊界融合，四周有少許結痂，創面黏附不如實驗組，移植物顏色較正常皮膚深。

2.6流式細胞儀對淋巴細胞亞型分析結果

T淋巴細胞，主要殺傷病原體感染細胞及腫瘤細胞，其表面標志物CD3，與TCR形成復合體，是T細++胞識別抗原和轉導信號的主要單位。CD3/CD4：輔++助性T細胞，CD3/CD8：殺傷性T細胞，++CD4/CD8的比值：評價那些自身免疫失調或被懷疑是免疫失調或已知患有免疫缺陷病人的免疫狀態。++流式結果顯示：實驗組CD3/CD4絕對數值、++CD4/CD8的比值均比對照組和空白組高。流式細胞檢測結果，實驗組：A.001右上角為CD4/CD3、CD8/CD3雙陽性T細胞，分別占淋巴細胞的27.32%、25.72%；陰性對照組：CD4/CD3、CD8/CD3雙陽性T細胞，分別占淋巴細胞的10.41%、27.05%；空白對照組：CD4/CD3、CD8/CD3雙陽性T細胞，分別占淋巴細胞的14.49%、21.94%。

3討論

vIL-10是EB病毒編碼的一種人白細胞介素[1]10（IL-10）的類似物，vIL-10可直接作用于T細胞，抑制B7受體如CD28、CTLA4介導的共刺激信號[2]。vIL-10作為一個具有免疫抑制作用的細胞因子[3]，在器官移植方面獲得廣泛研究。局部轉染vIL-10可導致機體對同源和異源移植腫瘤不排斥，用vIL-10蛋白處理骨髓樹突狀細胞或用逆轉錄病毒轉[4]導vIL-10可使T細胞功能降低。大量不同的T細胞亞群已被證實具有體內外免疫[5]++抑制作用，CD3/CD4：輔助性T細胞可分泌不同的細胞因子，具有輔助其它免疫細胞分化和調節免疫++應答的作用。CD3/CD8：殺傷性T細胞，它在T細胞++免疫應答中發揮重要功能。CD4/CD8比值可用于評價那些自身免疫失調或被懷疑免疫失調或已知患有++免疫缺陷病人的免疫狀態，CD4/CD8升高見于自身[6-7]++免疫性疾病、免疫耐受等。CD4/CD8降低見于病[8-9]毒感染，惡性腫瘤，再生障礙性貧血等。骨髓基質干細胞是起源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。MSCs由于具有易獲取、體外擴增迅速、容易轉染等特點而[10]成為理想的基因治療載體。目前的干細胞移植治療通常分為3種：增殖后直接移植、誘導分化后移植和干細胞經基因修飾后移植。將各種因子的基因通過轉染技術,使其在種子細胞內表達，然后將這種轉染細胞用于組織工程構建,在實驗研究中已獲得成[11]功，比如BMP22、BMP24、BMP27、BMP-2基因轉染誘導成骨細胞，可加速成骨過程及骨修復能力。不同基因修飾后，干細胞可能會出現不同程度的細胞生物學和/或分子生物學的變化，這種基因相關的個性改變應逐一進行檢驗，以確定干細胞為種子的細胞治療和組織工程治療的有效性。本實驗采用的是構建真核表達載體直接轉染骨髓基質干細胞，因此沒有必要研究外源基因修飾后干細胞的生物學特性的改變。同種異體間的免疫排斥反應是異體皮膚移植失敗的主要原因，誘導免疫耐受是增加移植皮片存活[5]的關鍵。目前應用同種異體和異種皮膚移植治療大面積燒傷，因組織相容性不理想，會受到免疫排斥反應而被排斥，故只能作為暫時性覆蓋創面之用。本實驗中，通過構建攜帶vIL-10目的基因的真核表達載體，轉染到骨髓基質干細胞中，腹腔注射于大鼠體內，4周后異體植皮，移植皮片存活質量提高以++及外周血CD4淋巴細胞數值升高，CD8數值降低，++CD4/CD8比值增高，這提示注射轉染vIL-10的骨髓基質干細胞可以降低異體移植間的免疫排斥反應。本實驗成功構建了攜帶vIL-10目的基因的真核表達載體，為同種異體皮膚移植基因治療的動物實驗研究提供了一個新的突破點。

【參考文獻】

[1]張慶毅.轉基因誘導移植耐受的研究進展[J].國外醫學免疫學分冊,2002,25(3):113-116.

[3]張寧,唐福林.vIL-10轉基因治療兔膝關節炎模型的試驗研究[J].中國免疫學雜志,1000-484X(2006):11-1060-03.

[4]張寧,唐福林.攜帶vIL-10的逆轉錄病毒重組體的構建及體外表達研究[J].中國免疫學雜志，1000-484X(2005):12-0899-03.

[5]奚瑾.潘志強.CD4CD25調節性T細胞參與大鼠角膜移植免疫耐受的研究[J].中華眼科雜志,2007,43:1114-1118.

[10]馮一梅,徐輝.間充質干細胞基因轉染的相關研究現狀[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(11):2119-2121.

作者：高學軍 陳振雨  蔡霞 單位：青島大學附屬醫院