大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因研究范文

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《海洋學報》2015年第十一期

1引言

隨著海洋環境與資源的不斷開發與利用，海洋也逐步成為耐藥性微生物及其耐藥基因的重要儲存庫。耐藥細菌也會隨雨水沖刷、潮汐和海流帶入近岸海濱旅游區，通過菌種間遺傳物質的傳遞，耐藥基因有可能被傳入海水環境中的人體病原菌。由于海灘娛樂水域承載了大量的游客，這些耐藥性致病菌可通過海水吞咽引發游泳人群致命性腸道疾病，因而大大增加了人體耐藥病原菌病害發生和流行的可能性。大腸桿菌（Escherichiacoli）作為海產品及海洋環境糞便污染的重要指示微生物，是臨床上引起感染最常見的腸桿菌科細菌之一，致病性的大腸桿菌會引發嚴重的腹瀉和敗血癥等疾病。2013年中國CHI－NET細菌耐藥性監測結果顯示，在各大醫院采集臨床分離菌的8萬多株菌中耐藥性大腸桿菌的檢出率最高。作為引起人類感染最常見的腸桿菌科細菌，大腸桿菌也是耐藥基因的主要儲存庫，在耐藥基因的傳播中發揮著重要作用。此外，臨床上發現，大腸桿菌的多重耐性現象較嚴重，并且多重耐藥性的大腸桿菌已被發現于近岸海水中。耐藥性大腸桿菌及其耐藥性基因會通過海產品或海水吞咽等途徑傳遞給人類，使抗菌藥對人類疾病的治療效果下降或消失，成為威脅人類健康的重大公共衛生問題。

目前，國外僅有少數關于海水浴場中大腸桿菌耐藥性的報道，如Turgeon等人通過檢測比較2004年與2005年在魁北克南部近200個浴場中采集的海水樣品發現海水浴場中耐藥性大腸桿菌的檢出率升高了10％。國內僅在北黃海近岸海域開展了抗磺胺類大腸桿菌的分布調查，并且采用的是化學分析方法，而對娛樂海水浴場中耐藥性大腸桿菌的研究還未見報道。此外，目前國外的研究僅局限于海水浴場中大腸桿菌耐藥性狀況的檢測層面，對其在海水浴場中的傳播擴散因子———耐藥基因的分布研究尚未開展。因此，我們對大連星海浴場中大腸桿菌耐藥性及其耐藥基因進行研究，通過藥敏實驗分析了海水浴場中大腸桿菌的耐藥性狀況，根據抗生素敏感性檢測結果采用PCR方法對受試大腸桿菌四環素耐藥基因進行分析。本研究的開展將有助于了解娛樂海水對人體健康的影響，并為相關管理部門進行的海水浴場風險評價提供數據支持，對浴場中耐藥基因污染的深入研究具有重要意義。

2材料與方法

2．1材料

2．1．1樣品采集于2014年8月進行樣品采集，水樣采自大連星海浴場距岸邊約30m游泳人群密集處，無菌玻璃瓶采集表層（10～15cm）海水，低溫保存運至實驗室。

2．1．2抗生素及生化鑒定管選取臨床上治療大腸桿菌感染常用的9種抗生素：四環素（TCY）、哌拉西林（PIP）、氨曲南（ATM）、左氧氟沙星（LYX）、頭孢噻吩（CEP）、復方新諾明（SXT）、鏈霉素（STR）、慶大霉素（GEN）、氯霉素（CHL），這9種抗生素均購自杭州天和微生物試劑有限公司。實驗中所選腸桿菌科細菌生化編碼微量鑒定管及參照的腸桿菌科細菌生化編碼鑒定手冊由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

2．1．3菌株及培養基實驗用大腸桿菌質控菌株為標準菌株大腸桿菌ATCC25922，購自廣東環凱微生物科技有限公司。實驗所需的培養基有4種：m－TEC，用于大腸桿菌分離培養；LB瓊脂，用于菌種的純化；EC肉湯，用于大腸桿菌生化鑒定；水解酪蛋白瓊脂（Mueller－Hinton，MH），用于藥敏實驗。

2．2大腸桿菌的分離鑒定

2．2．1大腸桿菌的分離使用濾膜法對大連星海浴場表層海水中的大腸桿菌進行過濾，水樣過濾后濾膜置于m－TEC瓊脂培養基上，于（35±1）℃培養2h，再以（44．5±0．5）℃培養16～18h。挑取黃色和黃棕色菌落初步鑒定為疑似大腸桿菌。于LB瓊脂培養基上劃線分離純化。37℃培養過夜，直至平板上長出單一相同的菌落。

2．2．2生理生化鑒定用接種針在LB瓊脂培養基上挑取單菌落，接種于腸桿菌科細菌生化編碼微量鑒定管，進行以下15種試驗項目：硫化氫實驗、苯丙酸鹽實驗、葡萄糖酸鹽實驗、吲哚實驗、葡磷胨水實驗、枸櫞酸鹽實驗、尿素實驗、半固體實驗、葡萄糖產氣實驗、賴氨酸實驗、鳥氨酸實驗、棉子糖實驗、山梨醇實驗、側金盞花醇實驗、木膠糖實驗。將鑒定管置于37℃恒溫培養24h后，依據生化反應結果，參照細菌鑒定編碼冊進行判斷并編碼，再按照編碼值檢索生化編碼表，即可獲得對應的結果。

2．3抗生素敏感性檢測采用CLSI推薦的K－B藥敏紙片擴散法研究大腸桿菌對9種常用抗生素的耐藥性。細菌藥敏實驗結果參照CLSI公布的標準以敏感、中敏、耐藥3種形式對抑菌圈大小作出解釋。采用UHONET5．6軟件對藥敏結果進行分析。抗生素敏感性檢測過程中采用大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株。

2．4四環素耐藥基因檢測為檢測大腸桿菌中四環素耐藥基因的分布，選取海水環境中常見的6種四環素耐藥基因（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG）為檢測對象，以大腸桿菌基因組DNA和質粒DNA為模板進行四環素耐藥基因的PCR擴增。PCR反應條件及引物信息參照文獻［13］。25μL的PCR反應體系：2×TaqMasterMix12．5μL，上下游引物各0．25μL，DNA模板1μL，ddH2O11μL。基因組DNA和質粒DNA的提取均參照試劑盒（天根生物公司的基因組DNA和質粒DNA提取試劑盒）說明書。

2．5統計學分析應用SPSS軟件，根據對大腸桿菌分離菌株體外四環素藥物敏感性和四環素耐藥基因PCR檢測結果，將四環素耐藥基因陽性菌株數與四環素耐藥菌株數進行χ2檢驗，對四環素耐藥基因陽性菌株中的耐四環素菌株數與四環素耐藥基因陰性菌株數進行比較，分析大腸桿菌的四環素耐藥性與四環素耐藥基因陽性檢出率的相關性。

3結果

3．1生理生化鑒定對在m－TEC瓊脂培養基上初篩得到的138株疑似大腸桿菌菌株進行生理生化鑒定，結果如表1所示。由表1可知，其中41株為大腸桿菌，分離率為30％，其余77株為非腸桿菌科細菌。這說明使用m－TEC瓊脂培養基應用于海水中大腸桿菌的分離率較低。

3．2藥敏實驗41株大腸桿菌對9種常用抗生素的藥敏實驗結果顯示，66％的受試大腸桿菌被檢測到耐藥性。其中受試菌株對四環素的耐藥率最高（46％），對頭孢噻吩和復方新諾明也呈現較高耐藥性，耐藥率達到30％以上。受試菌株對哌拉西林、左氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素和氯霉素的耐藥率也達到了近20％。而對氨曲南耐藥率最低（5％）（表2）。41株大腸桿菌的多重耐藥率為34％，最高耐抗生素個數達到7（表3）。

3．3四環素耐藥基因的PCR檢測

3．3．1基因組DNA中四環素耐藥基因檢測采用PCR方法對41株大腸桿菌基因組DNA中的四環素耐藥基因tet（A，B，C，D，E，G）進行檢測，結果顯示，僅耐藥基因tetA和tetB被檢測到，檢出率分別為34％和2％（表4）。四環素耐藥菌株中14株（63％）檢測到tetA基因，1株（5％）檢測到tetB基因，2株四環素敏感菌株檢測到tetA基因，推測其原因為攜帶四環素耐藥基因但并未表達。其他四環素耐藥基因檢測結果均為陰性。實驗結果中四環素耐藥基因檢測結果為陽性的菌株，四環素耐藥菌株占了很大比率，tetA檢測為陽性的菌株中86％為四環素耐藥菌株，tetB檢測為陽性的菌株中100％為四環素耐藥菌株，這表明四環素耐藥基因在基因組DNA中的攜帶情況與耐藥菌株的四環素耐藥表型可能存在一定的相關性。

3．3．2質粒DNA中四環素耐藥基因檢測大腸桿菌質粒DNA中四環素耐藥基因檢測結果顯示，41株受試大腸桿菌中tetA的檢出率為29％，而tetB的檢出率為12％。四環素耐藥基因tetA陽性菌株中91％為四環素耐藥菌株，tetB陽性菌株中全部為四環素耐藥菌株（表5），這說明四環素耐藥基因在質粒DNA中的攜帶情況與耐藥菌株的四環素耐藥表型存在一定的相關性。

3．3．3四環素耐藥表型與四環素耐藥基因的相關性分析41株分離菌株中，有19株為四環素耐藥菌株，耐藥率為46％。大腸桿菌基因組DNA與質粒DNA中四環素耐藥基因的檢測結果顯示，四環素耐藥基因陽性菌株中四環素耐藥菌株所占比例較高，分別為86．7％和94．1％。為進一步驗證四環素耐藥基因陽性菌株數與四環素耐藥菌株數之間的相關性，將二者進行χ2檢驗，發現四環素耐藥基因陽性菌株中的四環素耐藥菌株數顯著高于四環素耐藥基因陰性菌株，表明大腸桿菌的四環素耐藥性與四環素耐藥基因陽性檢出率相關。

4討論

本文采用m－TEC瓊脂培養基在大連星海浴場海水中初篩獲得138株疑似大腸桿菌，經生理生化鑒定發現41株分離菌株為大腸桿菌，這說明應用于m－TEC瓊脂培養基方法對海水中大腸桿菌的分離率較低。藥敏試驗結果顯示，66％的受試大腸桿菌被檢測到耐藥性，受試大腸桿菌對9種抗生素中四環素的耐藥率最高。這可能與四環素類藥物（包括四環素、土霉素、金霉素、強力霉素等）在我國使用時間較長，應用范圍較廣有關。相反，由于氨曲南等藥物的臨床使用相對較少，在藥物使用的選擇壓力下，反映為抗生素的耐藥率相對較低，這與國外的相關研究結果一致。如在印度東南部杜蒂戈林海岸的海洋生物中篩選出的168株大腸桿菌中，其中對四環素的耐藥率達到了26％；韓國學者對GOMSO海灣表層海水中篩選出的131株大腸桿菌進行耐藥性研究發現，四環素耐藥率為33．6％、鏈霉素11．5％、氯霉素9．9％、慶大霉素0．8％。本研究發現大連星海浴場海水中大腸桿菌不但普遍存在抗生素抗性，而且其多重耐藥率較高，這說明星海浴場中多重耐藥情況明顯，而多重耐藥的產生會給人和動物疾病的治療帶來極大困難，因此海水浴場水質相關管理部門應引起重視。在本研究中，大腸桿菌對四環素的耐藥性最為普遍，為進一步了解我國海水浴場海水中大腸桿菌四環素耐藥性傳播機制，本文初步研究了大腸桿菌中四環素耐藥基因的分布。前期研究發現，海水環境中的細菌至少有7種以上不同質粒編碼的四環素耐藥基因（tetA，tetB，tetC，tetD，tetE，tetG，tetY等），并且世界上不同海域內主要四環素耐藥基因的種類和組成有很大的差異，這種差異不但與地理分布有關，而且還與細菌耐藥性的進化有關。普遍認為主動外排作用和核糖體保護作用是細菌對四環素產生耐藥性的主要機制，其中大腸桿菌以主動外排機制為主［20］，研究較多的主動外排基因分別為tetA，tetB和tetC等，其中tetA與tetC作為代表四環素類藥物外排機制的基因廣泛存在于很多細菌中。本研究發現受試大腸桿菌無論是基因組DNA還是質粒DNA中僅四環素耐藥基因tetA和tetB被檢測到，而且tetA的檢出率最高，因此推測海水浴場海水中大腸桿菌四環素耐藥性可能主要由tetA基因傳遞，主動外排機制可能為本研究中試驗菌株四環素耐藥的主要機制。FanW等［22］在世界范圍內收集了107株耐四環素大腸桿菌分離株，用多重PCR方法檢測四環素耐藥基因，結果發現其中49．5％含tetA基因，35．5％含tetB基因，5．6％含tetC基因，1．9％含tetD基因。以上數據說明tetA基因和tetB基因可能在大腸桿菌中分布廣泛，這兩種基因尤其是tetA基因作為四環素外排泵基因，在四環素耐藥性方面起到主要作用。通過檢測四環素耐藥基因還發現，四環素耐藥基因檢測結果為陽性的菌株在耐四環素的大腸桿菌中占了很大比率，這說明四環素耐藥基因的攜帶情況與耐藥菌株的四環素耐藥表型可能存在一定的相關性。將四環素耐藥基因陽性菌株數與四環素耐藥菌株數進行χ2檢驗發現，四環素耐藥基因陽性菌株中的耐四環素菌株數顯著高于四環素耐藥基因陰性菌株數，這表明大腸桿菌的四環素耐藥表型與四環素耐藥基因陽性檢出率相關，因此進一步推斷在本研究中大腸桿菌四環素耐藥性的產生可能是由tetA和tetB基因介導的。

5結論

（1）采用K－B藥敏紙片擴散法研究發現，大連星海浴場表層海水中大腸桿菌耐藥情況嚴重，其中對四環素的耐藥率最高，并且多重耐藥狀況明顯。（2）對分離的大腸桿菌進行四環素耐藥基因檢測發現，主動外排基因tetA與tetB被檢測到，主動外排機制被推測為受試菌株四環素耐藥的主要機制。（3）海水中受試大腸桿菌的四環素耐藥表型與四環素耐藥基因陽性檢出率顯著相關，其耐藥性的產生可能是由tetA和tetB基因介導的。

作者：王玥 蘇潔 明紅霞 石巖 趙莎 關道明 樊景鳳 單位：國家海洋環境監測中心 國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室 大連海洋大學 水產與生命學院