豬無透明帶卵母細胞的優化范文

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《基因組學與應用生物學雜志》2015年第四期

1結果與分析

1.1不同濃度的鏈霉蛋白酶消化卵母細胞后極體貼附率在不同鏈霉蛋白酶濃度下的細胞恢復率較好，由表1可知，濃度為2mg/mL鏈霉蛋白酶消化卵母細胞后極體貼附率顯著高于其它濃度消化卵母細胞的極體貼附率，1mg/mL、2mg/mL兩個濃度處理組的后期發育的亂列率顯著高于其它濃度處理組(p<0.05)，詳見圖1。

1.2不同電場強度對無帶卵母細胞孤雌激活效率的影響比較三組不同電場強度40V/mm、60V/mm、80V/mm，對卵母細胞孤雌激活效率的影響，由表2可知無帶卵母細胞在三組場強激活后的卵裂率差異不顯著，但80V/mm場強激活后的囊胚率顯著高于其它兩組的囊胚率(p<0.05)。

1.3不同脈沖次數對無帶卵母細胞孤雌激活效率的影響在相同場強相同脈沖時程(60V/mm,80滋s)的條件下，比較不同脈沖次數1次、2次、3次對無帶卵母細胞孤雌激活效率的影響，由表3可知無帶卵母細胞在三組不同的脈沖次數中激活后的卵裂率差異不顯著，但2次脈沖激活后的囊胚率顯著高于其它兩組的囊胚率(p<0.05)。

1.4不同微穴大小對無透明帶胚胎的容納能力比較了底部直徑約為150滋m，深度約為200滋m，簡稱(1)；底部直徑約為l20滋m，深度約為150滋m，簡稱(2)，兩種不同微穴大小對無透明帶胚胎的容納能力的大小。由表4可知，無透明帶孤雌激活胚胎在兩種穴中容納的卵裂率差異不顯著，但在(2)穴中容納的囊胚率略高于在(1)穴中容納的囊胚率，但差異不顯著，詳見圖2。

2討論

透明帶是圍繞在卵母細胞外周的糖蛋白基質，對卵母細胞的成熟，胚胎的發育起著重要的作用。自從手工克隆技術問世以來，顛覆了一個傳統的概念：透明帶是胚胎發育過程所非必需的。Vajta等(2003)研究表明在有血清存在的條件下，即使卵母細胞的數量很多，用鏈酶蛋白酶消化透明帶是一種高效而無損害的方法。很多研究者都用3.3mg/mL鏈酶蛋白酶消化卵母細胞的透明帶(Vajtaetal.,2004;Lietal.,2006;Duetal.,2007)。本研究得出的最適宜透明帶消化的濃度為2mg/mL，得到的極體貼附率，卵裂率最高。這可能與卵母細胞本身的質量，實驗室自身的體系，操作者的操作程序等因素有關。影響豬卵母細胞孤雌激活的因素有很多，比如激活液的種類、激活方法、電參數、激活時間等等，卵母細胞的活化是由這些因素的共同起作用的。其中電激活方法比較常用，Miyazaki等(1986)研究認為對卵母細胞施加電場時，其透明帶會出現微孔，通過誘導激活IP3系統，釋放鈣庫中的Ca2+，從而激活卵母細胞。Fissore等(1992)研究表明電場強度、電脈沖次數等因素通過對細胞內Ca2+的變化以及卵母細胞對Ca2+敏感性的調節從而影響卵母細胞的激活。因此電激活的場強，脈沖參數對卵母細胞的活化是相當關鍵的。對于無透明帶保護的卵母細胞孤雌激活的參數更值得關注。Kragh等(2005)研究表明用低場強60V/mm激活無帶卵母細胞的效率比激活完整透明帶的要高。本研究得出的低場強激活無帶卵母細胞的效率更高的結論與此是一致的。Collas等(1993)研究認為多次使用電脈沖引發Ca2+離子持續內流，達到真實模擬正常受精過程Ca2+的節律性脈沖升高，從而使得卵母細胞徹底激活。因此增加電脈沖次數，其激活率明顯升高。Zhu等(2002)研究表明豬卵母細胞孤雌激活中使用3次脈沖得到的囊胚率最高。Feltrin等(2006)在牛的手工克隆中使用2次電脈沖激活無透明帶胚胎得到了較高的囊胚發育率。本試驗無帶卵母細胞的激活，得到的最佳脈沖次數為2次，與Feltrin等(2005)的研究結果相符合。培養無透明帶胚胎的方法有：微滴法和微穴法。Vajta等(2000)研究表明微穴培養法適合透明帶完整以及無透明的胚胎培養，而且微穴法卵裂率和囊胚率均顯著高于微滴法(20.98%vs12.77%,p<0.05)。Vajta等(2000)在牛上微滴法培養單個無帶胚胎囊胚率達29%，而本試驗的囊胚率也達到20.68%，可能由于物種不同囊胚率略有差異，但與其研究結果基本一致。目前國內對于無透明帶胚胎培養最佳微穴大小的報道較為少見，Feltrin等(2005)研究表明小尺寸微穴(內徑130滋m,深度150滋m)中胚胎發育的卵裂率(80.9%vs64.1%)及囊胚率(25.3%vs11.9%)都高于大尺寸微穴(內徑280滋m,深度250滋m)的發育率。本研究的試驗結果也表明體積較小的微穴能較好地容納無透明帶囊胚，其囊胚率略高于較大微穴的囊胚，但兩者的卵裂率差異不顯著，與前者的研究結果基本一致。

3材料與方法

3.1實驗材料

3.1.1主要試劑耗材TCM-199為GICO公司生產，胎牛血清(FCS)為Hyclone公司生產，除特別注明外，其它所有無機鹽和生物化學試劑均為Sigma公司生產。配制溶液的三蒸水均為南寧本地水。實體顯微鏡(日本NIKON)，CO2培養箱(ThermoLifeScience)，融合槽型號BTX-450(SanDiego,USA)，卵母細胞成熟培養皿：35mm及60mm塑料平皿(BDFalcon,USA)，胚胎聚集針DN-10。

3.1.2卵母細胞成熟豬的卵巢來源于南寧市屠宰場，裝入含有雙抗(青霉素、鏈霉素)25~35℃的生理鹽水中，用保溫壺4h之內送回實驗室。用10mL的注射器抽取直徑為2~6mm的卵泡，經沉淀后收集有3層顆粒細胞包被的卵丘卵母細胞復合體(CoCs)，經體外成熟(IVM)44h后，收集有第一極體的成熟卵母細胞用于實驗。

3.2實驗方法

3.2.1消化透明帶根據試驗的要求設置不同的鏈霉蛋白酶濃度進行透明帶的消化，待其恢復成圓形挑出留作后續試驗。

3.2.2電激活根據試驗的要求設置不同的電激活參數，在電融合槽中對卵母細胞進行激活。

3.2.3化學激活將融電激活后的卵母細胞放入含5滋g/mLCB和10滋g/mLCHX的PZM-3激活液中激活，每滴激活液中放入1枚重構胚，激活4h。

3.2.4胚胎的培養將激活后的胚胎轉移到預先在CO2培養箱中平衡至少4h并且有石蠟油覆蓋的PZM-3中的微穴中。微穴的制備：用胚胎聚集針在四孔板底部均勻旋轉扎微穴，微穴大小根據試驗的要求設置，每個微穴中放入1枚胚胎。48h觀察卵裂率，160~168h觀察囊胚率。

3.3試驗設計試驗一：比較不同濃度的鏈霉蛋白酶1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL消化卵母細胞后極體貼附率及卵裂率。試驗二：比較不同電場強度(40V/mm,60V/mm,80V/mm)對無帶卵母細胞孤雌激活效率的影響。試驗三：比較不同脈沖次數(1次,2次,3次)對無帶卵母細胞孤雌激活效率的影響。試驗四：比較不同微穴大小對無透明帶胚胎的容納能力。

3.4數據統計所得數據由SPSS軟件進行統計分析，試驗每重復一次均為同一批次試驗，使用相同來源的卵巢和試驗條件，所有試驗至少重復4次。

4結論

消化透明帶的最佳鏈霉蛋白酶濃度為2mg/mL；最佳電激活參數為：70V/mm電壓，80滋s脈沖時間：2次脈沖；較適宜容納孤雌激活胚胎的微穴大小為：底部直徑約為l20滋m，深度約為150滋m。作者貢獻呂玲燕負責論文初稿的撰寫；孫俊銘和陸杏蓉負責數據的統計分析及整理；潘翠玲和關志惠協助試驗的開展；潘天彪、崔奎青和謝炳坤負責本文構思、審閱、修改、定稿。致謝本研究由國家自然科學基金(31160457)和廣西畜牧研究所基本科研業務費項目基金(桂牧研科2014-02)共同資助。

作者：呂玲燕孫俊銘陸杏蓉潘翠玲 關志惠潘天彪謝炳坤單位：廣西壯族自治區畜牧研究所廣西家畜遺傳改良重點實驗室廣西大學亞熱帶生物資源保護利用國家重點實驗室廣西壯族自治區水牛研究所