淺析“三月花”黃花菜的組織培養范文

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摘要:采用單因素和正交實驗方法對“三月花”黃花菜的組織培養技術進行了探索．結果顯示:幼葉用0．1%升汞滅菌12min時效果最佳，外植體污染率、死亡率均為0，14d后外植體啟動率為62．5%．最佳愈傷誘導培養基為MS+2mg/L2，4-D+0．1mg/L6-BA，外植體出愈率為86．67%;愈傷組織最適分化培養基為MS+2mg/L6-BA+0．5mg/LIBA，愈傷組織分化率達到80%，平均每塊愈傷組織不定芽個數為1．72．最佳生根培養基為1/2MS+0．5mg/LNAA，生根率達到93．33%，平均每個芽苗生根數為5．83條，試管苗煉苗移栽后，成活率達95%．利用該組織培養技術，幼葉外植體通過愈傷組織途徑獲得“三月花”黃花菜再生苗．

關鍵詞:“三月花”黃花菜;幼葉;愈傷組織途徑;快繁

1引言

黃花菜(HemerocalliscitrineBaroni)又名金針菜，為百合科多年生宿根草本植物［1］，是我國特有的重要經濟植物．黃花菜以其花香、色黃亮、味美、營養豐富而聞名，屬于典型的高蛋白、低熱量、富含維生素及礦物質的保健蔬菜［2，3］，具有較高的市場價值［4］．目前，在黃花菜種苗繁殖中，多采用分株、切片、芽塊等方法，速度慢，難以滿足種苗批量生產的需求［1，5，6］．為了解決黃花菜種苗的產業化生產，許多學者研究了黃花菜的組織培養技術［7］．周樸華取其各種長度的雄蕊［8］、近成熟蒴果、花藥和幼葉［9］培育出完整的植株．祝朋芳取金娃娃萱草與黃花菜雜交授粉后1～8d的子房中的胚珠誘導出植株［10］．岳青、王果萍分別采用短縮莖、心葉、花莖、花蕾為材料誘導植株，發現心葉可以長出愈傷組織，但很難進一步分化成植株，花莖、花蕾在培養基上均能不同程度地產生愈傷組織，但條件相同時，花蕾的誘導率高于花莖［11］．董推茹［12］采用多倍體黃花菜的幼葉、花蕾和花莖3種外植體發現僅有花莖形成愈傷組織，而花蕾、幼葉無分化跡象．這些研究表明相同組織或器官誘導愈傷組織的效果存在差異，不同品種間由于基因型的差異對誘導條件的反應也存在差異．“三月花”黃花菜早花品種，具有花期早于市場其他品種的優勢．本研究以較易獲得的幼葉為外植體，建立其培養體系，以滿足生產需要．

2材料與方法

2．1材料“三月花”黃花菜由四川德陽市明潤農業開發有限公司提供．

2．2方法2．2．1外植體最佳滅菌條件的優化取“三月花”黃花菜的幼葉(叢生枝頂中心周圍肉眼可見的幼葉，顏色為淡黃綠色，長寬1～8cm×0．5～1cm)，流水沖洗后，采用以下流程滅菌．無菌水1～2次70%酒精30s無菌水1～2次0．1%HgCl2無菌水5～6次．將滅菌后的幼葉切成約1．0×0．5cm2大小，接種于MS［7］+0．2mg/L6－BA+2mg/L2，4-D培養基中，每瓶接種4個幼葉外植體，每個處理接種15瓶．放置于暗培養箱中培養，控制室溫為25±2℃．記錄14d后外植體啟動率、污染率及死亡率．(1)污染率=(被污染的外植體數/接種的總外植體數)×100%(2)死亡率=(非因污染造成的死亡的數量/接種的總外植體數)×100%(3)啟動率=(啟動的外植體數/接種的總外植體數)×100%(外植體膨大視為啟動)2．2．2植物激素對幼葉外植體出愈率的影響以MS為基本培養基，蔗糖30g/L，瓊脂6．5g/L，pH5．8～6．2，在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20min，冷卻后加入過濾滅菌的植物激素配制成不同激素濃度的培養基，將最佳滅菌條件下處理的幼葉外植體接種于培養基上進行愈傷組織誘導．每瓶接種4個幼葉外植體，每個處理接種15瓶．放置于暗培養箱中進行培養，控制室溫為25±2℃，分別在7、30d觀察啟動率和出愈率(外植體膨大并形成細胞團)．2．2．3正交實驗探究植物激素對幼葉外植體出愈率的影響根據單因素結果，選取對幼葉啟動和出愈影響較大的激素進行二因素三水平的正交試驗，以選擇最佳的激素組合配比，實驗方法與材料同上．2．2．4愈傷組織的分化培養將愈傷組織切成0．6cm3的小塊，接種于MS添加6-BA(2mg/L)以及不同濃度的IBA、IAA、NAA分化培養基中，光照1500lx，光照時間12h/d．30d后統計結果．2．2．5生根及煉苗移栽將芽苗轉接到添加不同濃度激素的1/2MS生根培養基上，觀察根的長勢．當根長至5～7cm時即可打開瓶塞，煉苗2～3d后，洗掉根部培養基，移入腐殖質∶沙=1∶1基質中栽培．

3結果與分析

3．1最佳滅菌條件14d后幼葉外植體的污染、死亡和啟動狀況見圖1，結果顯示外植體啟動率表現出會隨著滅菌時間的延長先升后降，綜合污染率、死亡率和啟動率三者的情況，幼葉外植體滅菌12min為最佳效果，此時外植體污染率和死亡率都最低，幼葉外植體14d后啟動率則接近最高值為62．5%．

3．2植物激素種類對幼葉外植體誘導率的影響觀察幼葉外植體啟動率和30d后的出愈率(表1)，發現單獨的6-BA不能使幼葉外植體啟動，但是和生長素配合使用則有助于誘導幼葉外植體啟動或出愈．NAA無論單獨還是和6-BA配合使用都可以使幼葉外植體膨大，但并無愈傷組織生長，并且褐化死亡．2，4-D無論單獨使用還是和6-BA配合使用都可以誘導幼葉外植體啟動和出愈，但是單獨的2，4-D誘導愈傷組織，會使愈傷組織松散，不利于后面的轉接和分化，添加一定的6-BA會使愈傷組織變得緊實，產生更多的芽點(圖2-a)，利于愈傷分化．但是過低或者過高的6-BA反而會抑制幼葉外植體的誘導，并且啟動率和出愈率之間有一定的正相關性．因此選取2，4-D和6-BA兩個因素進行二因素三水平的正交實驗．

3．3正交實驗探究植物激素對幼葉外植體出愈率的影響從表2的極差結果(R)可以看出，幼葉外植體出愈率的影響因素中6-BA大于2，4-D．外植體出愈率最高的培養基為MS+2mg/L2，4-D+0．1mg/L6-BA．在此激素濃度配比下，外植體啟動率和出愈率都最高，分別達到68．33%和86．67%．3．4愈傷組織的分化培養將愈傷組織接種到IBA/NAA/IAA配合6-BA的誘導分化培養基上，30d后觀察結果(表3)．結果顯示IBA的誘導分化效果顯著高于NAA和IAA．最佳分化培養基為MS+2mg/L6-BA+0．5mg/LIBA，愈傷組織分化率達到80%(圖2-b)，平均每塊愈傷組織不定芽個數為1．72.3．5生根及煉苗移栽將誘導出的芽苗(圖2-c)接種到添加NAA/IBA/IAA的1/2MS培養基上，20d后觀察結果(表4)．發現IBA和NAA都可以很好的誘導生根，綜合考慮生根率和平均生根數，NAA誘導生根的效果更好，芽苗平均生根數為5．83(圖2-d)多于IBA的平均生根數2．17，因此1/2MS+0．5mg/LNAA為最佳生根培養基．當根長至5～7cm時即可煉苗3－5天后移栽．由于植株吸收能力與根中根毛成正比，因此先把根毛少或無的再生苗移入濕濾紙或濕紗布中誘發根毛，根毛長出后再進行栽植．移栽基質用腐殖質∶沙=1∶1，成活率達95%(圖2-e)．

4討論

“三月花”黃花菜是明潤農業開發有限公司自主培育的新品種．該品種3月開花，早于其他品種2個月，不僅有市場優勢，而且由于開花時溫度較其他品種開花時低，有利于花蕾的采摘和保存．為推廣該品種的種植，需要建立高效的組織培養技術為其產業化生產提供種苗．由于黃花菜的幼芽生長于地下，數量少，且很難與根莖上其他附屬組織分開，難以獲取和滅菌，不能滿足生產需求，而黃花菜的幼葉材料豐富，容易獲得．幼葉經愈傷組織途徑獲得的組培苗雖然有變異的可能性，但常常發生在多次繼代之后，研究表明在繼代5代之內遺傳穩定性極高［13－15］．后期將進一步利用ISSR技術［16］檢測分析其遺傳穩定性．因此本研究中采用二步法進行組織培養．本研究中利用組織培養技術3個月后就可形成組培苗大大縮短育苗時間，增值系數約為4，為該品種產業化發展奠定了基礎．“三月花”黃花菜的其他外植體由于受季節的約束，研究中只對花梗、花蕾、花絲、花被筒、花藥、種子、根進行了初步的實驗，發現同等條件下花梗、花蕾有愈傷組織形成，但最佳的誘導條件仍需探究．

參考文獻:

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［5］張和義，唐愛均．黃花菜繁殖技術綜述［J］．中國農學通報，2003，19:205．

［6］劉鳳民，張偉麗．黃花菜組織培養再生系統研究［J］．廣東農業科學，2006，32．

［7］江華波，楊峰，江家榮，等．黃花菜組織快繁技術綜述［J］．北京農業，2014，124．

［8］周樸華，胡繼金，范鴻芝．從黃花菜誘導出胚狀體并發育成植株的研究［J］．園藝學報，1983，10:273．

［9］周樸華，胡繼金，范鴻芝．黃花菜(Hemerocallisfla-vaLinn)組織培養的初步研究［J］．湖南農學院學報，1980(4):47．

［10］祝朋芳，張利欣，劉莉．大花萱草與黃花菜雜交親和性及其幼胚離體培養［J］．北方園藝，2008，190．

［11］岳青，王果萍，童德中，等．大同黃花菜組織培養繁殖技術的研究［M］．北京:北京農業大學出版社，1995，500．

［12］董推茹，王瑞庫，王法政．多倍體黃花菜離體培養繁殖技術［J］．作物雜志，1995，10．

［13］邱婧，樊洪泓，秦自清，等．利用分子標記檢測霍山石斛不同繼代次數試管苗的遺傳穩定性［J］．分子植物育種，2008，6:532．

［14］高麗，楊波，李洪林．葉藝春蘭組培苗遺傳穩定性的ISSR研究［J］．亞熱帶植物科學，2007，36:13．

［17］馬騰蛟，陳杰，丁顯平，等．重慶南川區道地藥材玄參遺傳多樣性ISSR分析［J］．四川大學學報:自然科學版，2016，53:1119．

作者：王靜 胡冬梅 侯靜 白潔 單位：四川大學生命科學學院