食源性致病菌的多重PCR檢測范文

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《生物技術通報雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1材料

菌種名稱及編號，見表1。

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成根據沙門菌的hilA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因，應用PrimerPremier5.0分別設計如下3對特異性引物（表2），并送至生工生物（上海）有限公司合成。

1.2.2食源性致病菌的培養和基因組DNA的提取從保藏斜面中挑取合適的菌落置于LB液體培養基中，37℃恒溫培養24h后，再以140的比例轉接至新的LB培養液中37℃恒溫培養24h進行活化。最后以140的比例移接至新的LB培養液中37℃恒溫振蕩培養2-4h，至菌液OD600為0.7-1.0，用細菌DNA提取試劑盒分別提取3種菌的DNA，-20℃保存備用。

1.2.3單重PCR反應體系的建立單重PCR反應體系（50μL）：Taq酶0.25μL，10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA溶液3μL，引物（20μmol/L）各1μL，加去離子水至50μL。PCR參數：94℃預變性5min；94℃變性40s，50℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸7min。4℃保存。

1.2.4多重pcr反應體系的建立及優化將以上3對引物進行兩兩組合或三者混合，混合3種致病菌的基因組DNA作為模板進行PCR反應，驗證多重PCR反應的特異性及引物之間的相互作用。調整反應體系中的引物濃度和模板濃度等，優化多重PCR反應體系，反應程序同1.2.3。

1.2.5人工模擬樣品的PCR檢測分別制備沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的菌懸液，將3種培養液單獨接種鮮奶培養24h，或任意兩兩等量混合然后取少量接種到鮮奶中培養24h。對人工染菌的食品樣品先進行增菌，而后用試劑盒提取致病菌基因組DNA進行PCR檢測。以未染菌的食品作為陰性對照。

2結果

2.1菌種及靶點在NCBI的編號針對試驗所用的沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌這3個菌種，及篩選定出的靶基因，從NCBI網站上下載3種菌的基因組及其特異性靶點的序列。

2.2單重PCR反應體系驗證結果分別使用3種食源性致病菌所特有的特異性引物進行單重PCR反應，均能擴增出與預計大小相符的目的條帶（圖1），且無非特異性條帶和二聚體；腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因287bp；金黃色葡萄球菌的nuc基因354bp；沙門氏菌的hilA基因468bp；Marker和PCR產物的上樣量均為400ng?；厥?個PCR產物進行測序，并在線與NCBI數據庫中的相應種的序列進行比對，比對結果顯示序列同源性均在99%以上。

2.3PCR反應特異性實驗將3種致病菌的基因組DNA等量混合為模板，分別用一對引物進行PCR反應，結果顯示腸出血性大腸桿菌O157H7引物只能擴增出腸出血性大腸桿菌O157H7中287bp大小的條帶，沒有非特異性條帶和引物二聚體；金黃色葡萄球菌引物只能擴增出金黃色葡萄球菌的354bp大小的條帶，無非特異性條帶和引物二聚體；同樣沙門氏菌引物也只能擴增出沙門氏菌468bp大小的條帶，無其他非特異性條帶。這說明所設計的引物具有高度特異性。

2.4多重PCR反應體系的建立分別將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌的基因組DNA等量混合為模板，按優化的多重PCR反應體系進行擴增，結果（圖2）顯示，雙重PCR反應后在相應大小位置處出現了兩條特異性條帶，三重PCR反應后，在354、287和468bp處分別出現了明顯的特異性目的條帶，且無非特異性條帶和引物二聚體的形成，Marker和PCR產物的上樣量均為400ng。經過多次試驗，確定多重PCR的反應體系為：（50μL）：Taq酶0.25μL，10×PCRBuffer5μL，dNTPMixture4μL，模板DNA溶液3μL，引物（20μmol/l）各1μL，加去離子水至50μL。2.5人工模擬樣品的PCR檢測將沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌的培養液單獨接種至鮮奶中或任意兩兩等量混合取少量接種至鮮奶中培養。經增菌后提取致病菌基因組DNA進行PCR反應，結果（圖3）顯示，未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應致病菌的鮮奶均能檢測出對應的特異性目的條帶，Marker和PCR產物的上樣量均為400ng。以上結果說明本研究所建立的多重PCR檢測方法可應用于食品中的腸出血性大腸桿菌O157H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌3種致病菌的檢測，且該方法均有較高的特異性。

3討論

在經濟發展的現代，健康成為人們越來越關注的問題，食品的安全問題成為社會關注的焦點。PCR快速檢測技術因為其特異性強和靈敏度高，操作簡單，消耗時間和試劑少，現已用于肝炎、艾滋病、皰疹病毒感染診斷［16］，也成為了食源性致病菌的重要檢驗方法之一。在PCR檢測技術基礎上發展起來的多重PCR技術也廣泛地應用于食品檢測方面。目前用于檢測沙門氏菌的靶基因的引物基因主要有invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、hns、spv和16SrRNA，血清群特異性引物基因rfb基因和血清型特異性引物基因fliC、fljB和via基因等［13］。目前用于檢測腸出血性大腸桿菌O157：H7時，主要的毒力基因有：編碼志賀毒素stx1和stx2基因、編碼與細菌黏附作用有關的蛋白eaeA基因、編碼溶血素hly基因［14］。目前，用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SE的相關靶基因有sea、seb、sec、sed、see、seh、sei和sej基因［13］，以及編碼耐熱核酸酶基因nuc，編碼血漿凝固酶coa基因［15］。通過實驗，本研究所設計的沙門氏菌的引物hilA-f可有效擴增出468bp的特異性基因片段，腸出血性大腸桿菌O157H7的引物rfbE-f可有效擴增出287bp的特異性基因片段，金黃色葡萄球菌的引物nuc-f可有效擴增出354bp的特異性基因片段，這3對引物可成功用于致病菌的多重PCR快速檢測，此前未見報道。在食品中人工添加3種致病菌沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和金黃色葡萄球菌，利用本實驗所設計的3對引物可成功的進行多重PCR的快速檢測。本研究所建立的PCR反應系統具有較好的特異性，為食品中常見致病菌的檢測提供了一種快速、簡便、準確的方法，具有重要的理論意義及實踐意義。同時多重PCR可以與其他技術相結合，如熒光定量PCR相結合，可提高檢測效率。或是與其他檢測方法相結合，如基因芯片、實時PCR等，可以創造一個更完整的體系。

4結論

本研究針對常見的3種食源性致病菌腸出血性大腸桿菌O157H7的rfbE基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因及沙門氏菌的hilA基因，設計出相對應的特異性引物，單重PCR結果顯示能擴增出與預計大小一致的片段，沒有非特異性擴增。使用設計的引物對人工感染的鮮奶進行檢測，結果表明未加致病菌的鮮奶不能檢測出特異性條帶，而接種相應致病菌的鮮奶均能檢測出對應的特異性目的條帶。

作者：余倩黃夢娜單位：仲愷農業工程學院輕工食品學院