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《生物技術雜志》2014年第二期
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株及質粒E.coli菌株JM109(DE3)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheni-formis)均由作者實驗室保存。質粒:pSE380由作者實驗室保存(含Lac啟動子的表達載體)。質粒pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA由作者實驗室構建，工程菌BW25113△pflB△frdAB△fnr△fnrE由作者實驗室構建。
1.1.2工具酶和試劑限制性內切酶NcoⅠ、T4DNA連接酶、ProteinMarker、Primerstar聚合酶購自TAKARA公司;氨芐青霉素購自上海生物工程公司;所用試劑盒購自天根公司。
1.1.3培養基和培養條件細菌培養基:LB+氨芐青霉素(100mg/mL);淀粉酶活性篩選平板:LA+氨芐青霉素(100mg/mL)+2%淀粉。發酵培養基:5%木薯粉+0.5%酵母粉。
1.1.4發酵將過夜培養的種子液按5%的接種量接種于液體發酵培養基中，37℃、250r/min，長至OD600為0.4～0.6，加入終濃度1mmol的IPTG誘導，在37℃、250r/min發酵24h。
1.1.5PCR引物根據GenBank所報道的基因序列設計以下引物上游引物:5’－CGAGCCCATGGCTAAACAACAAAAACG－3’，NcoⅠ酶切位點;下游引物:5’－GTACCCATGGTCTGTTTCCTCTATCTTT-GAACATAAATTGAAACCG－3’，NcoⅠ酶切位點。
1.2方法
1.2.1DNA的提取Bacilluslicheniformis基因組DNA及質粒DNA的提取的快速提取參照文獻。
1.2.2PCR擴增擴增amyL基因反應體系為:10×PCR緩沖液10mL，dNTP(each2.5mmol/L)4mL，Primer1(10mol/L)和Primer2(10mol/L)各1mL，地衣芽孢桿菌總DNA1mL，PrimeSTARDNAPolymerase(2.5U/μL)2U，加ddH2O至50mL。反應條件:95℃變性2min;94℃30s，48℃30s，72℃2min，30個循環，最后72℃10min。
1.2.3分子克隆質粒DNA的提取、DN段的亞克隆、酶切和連接轉化技術參照文獻［6］，將等量的雙質粒pSE380－amyL、pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA同步轉入感受態細胞中，涂布在雙抗性(100mg/L氨芐青霉素+34mg/L氯霉素)LA平板上培養。
1.2.4淀粉酶陽性轉化子的檢測將轉化液涂布于含有2%可溶性淀粉的固體LA平板上，37℃過夜培養，周圍出現透明圈的即為淀粉酶陽性轉化子。
1.2.5重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達將陽性轉化菌落轉接入100mL的LB中，37℃振蕩培養2h至OD600約為0.1，加入IPTG至終濃度1mmol/L，誘導表達12h后，取1.5ml菌液于8000r/min，離心5min，收集菌體，用200μLddH2O重懸菌體，從中取20μL重懸菌液并加入等量的上樣buffer，100℃煮5min，進行SDS－PAGE電泳。
1.3異丁醇發酵
過夜培養的種子液按1%的接種量接種，37℃、250r/min培養，待其長至OD600約為0.4～0.6時加入終濃度1mmol的IPTG誘導，在30℃、250r/min發酵24h。
1.4分析方法
1.4.1質粒穩定性的檢測質粒穩定性的測定參照文獻［7］進行。
1.4.2異丁醇產量檢測檢測儀:Agilent6890氣相色譜儀。檢測條件:FID(220℃)檢測器;phenomenZB－WAXplus色譜柱;進樣口壓力為16.92psi;氫氣流量為30mL/min;柱箱溫度為100℃;進樣量0.2mL。
2結果與分析
2.1基因擴增提取地衣芽孢桿菌的總DNA作為模板，擴增amyl基因，用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，獲得一條大小約為1569bp單一特異性條帶，與預期目的條帶大小一致(圖1)。
2.2表達載體的鑒定將載體pSE380與PCR擴增amyl基因片段產物酶切并去磷酸化，連接轉入大腸桿菌JM109(DE3)中，涂布于篩選平板(含100mg/mL的Amp，IPTG，2%的淀粉)，37℃過夜培養24h，挑取其中6個有透明圈的單菌落轉點于新鮮的淀粉板上，24h后挑取透明圈較小的JM109(DE3)/pSE380－amyl－1及較大的JM109(DE3)/pSE380－amyl－2(如圖2)單菌落分別提質粒測序。通過測序的JM109(DE3)/pSE380－amyl－1及JM109(DE3)/pSE380－amyl－2，經培養、IPTG誘導表達后，分別取上清液及菌體沉淀進行SDS－PAGE電泳分析，結果如圖3，從圖3中可以看出，重組菌與對照菌相比發現在56kDa處出現特征蛋白條帶，與核酸序列理論推算蛋白質分子量基本相符，表明amyl基因已在大腸桿菌中成功地表達。
2.3pSE380－amyl與pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA共表達制備工程菌BW25113△pflB△frdAB△fnr△fnrE感受態，分步轉入pSE380－amyl－1(pSE380－amyl－2)和pSTV29－alsS－ilvC－ilvD－kdcA，獲得的工程菌命名為gxas－AIKA1(gxas－AIKA2)。
2.4質粒的穩定性檢測取工程菌gxas－AIKA連續傳代培養，定期取樣分別稀釋涂布于抗性平板與無抗性平板上，顯微計算出抗性平板上與無抗性平板上的菌落數之比，以此比值與培養時間聯合考察發現該工程菌株的穩定性良好。
2.5異丁醇產量測定內標:正丁醇。氣相分析結果如圖4、圖5，發現工程菌gx-as－AIKA1和gxas－AIKA2均能直接利用木薯淀粉生產異丁醇，并且工程菌gxas－AIKA1以5%木薯粉+0.5%酵母粉為發酵培養基發酵的效果更好。
3討論
由于在工業生產中直接利用葡萄糖作為發酵原材料的經濟成本較高，木薯淀粉作為產量大、價格便宜的可再生資源，用作發酵生產異丁醇的培養基原料有著獨特的優勢。本研究嘗試以地衣芽孢桿菌的基因組DNA為模板，PCR擴增了淀粉酶基因，構建了表達質粒pSE380－amyl，并將該質粒與接被本研究所構建的重組菌株發酵生產異丁醇。為了進一步提高工程菌直接利用木薯淀粉生產異丁醇的產量，本研究小組已經著手提高該菌株異丁醇耐受性，優化異丁醇發酵工藝水平的研究。
作者：郭媛林麗華龐浩陳燕劉春宇裴建新黃日波單位：廣西科學院非糧生物質酶解國家重點實驗室國家非糧生物質能源工程技術研究中心廣西生物煉制重點實驗室