低溫氨氮降解菌的篩選范文

本站小編為你精心準(zhǔn)備了低溫氨氮降解菌的篩選參考范文，愿這些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

《生物技術(shù)雜志》2014年第二期

1方法

1.1菌株富集培養(yǎng)取100mL松花江水放入無菌的500mL三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)3～5d直至培養(yǎng)液渾濁，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2氨氮降解菌篩選取1mL富集培養(yǎng)液加入含100mL異氧硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的三角瓶中，8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)2d，倍比稀釋后，取103稀釋液100mL涂布在異氧硝化細(xì)菌固體平板上，8℃低溫培養(yǎng)2～4d，挑取單菌落劃線純化。采用納氏試劑平板法初篩脫氨氮菌株，取純化后的菌株點(diǎn)接在異氧硝化細(xì)菌固體平板上，8℃低溫培養(yǎng)2d，去掉菌落，加入5mL納氏試劑，測量菌落周圍的透明圈直徑。

1.3菌株鑒定形態(tài)鑒定:將培養(yǎng)24h的菌液，革蘭氏染色后顯微鏡下觀察形狀大小。生理生化特性鑒定:按照參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行接觸酶、氧化酶、精氨酸雙水解酶、V.P試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、葡萄糖利用、明膠液化試驗(yàn)。16SrDNA序列分析:用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，離心收集菌體，用北京康為世紀(jì)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，用細(xì)菌通用引物Primer1:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和Primer2:TACGGYTACCTTGT-TACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測序，在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行DNA序列分析，用MEGAversion4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定:按照BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)說明進(jìn)行操作。

1.4菌株低溫氨氮降解能力測定用500mL基本培養(yǎng)液培養(yǎng)氨氮降解菌，離心收集菌體，用無菌水洗滌2次，懸浮于5mL無菌水中，作為種子液。取1mL種子液接種到50mL新的異氧硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中，3個(gè)平行樣，培養(yǎng)液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養(yǎng)液在8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)2d，每隔4h取樣測定菌濁度OD600值、氨氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度，計(jì)算氨氮降解率。

1.5菌株的反硝化能力取1mL種子液接種到50mL新的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)液中，3個(gè)平行樣，培養(yǎng)液初始氨氮濃度為5mg/L，碳氮比分別為10:1，pH7.0。將培養(yǎng)液在8℃、160r/min震蕩培養(yǎng)1d，每個(gè)4h取樣測定菌濁度OD600值、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮濃度，計(jì)算硝態(tài)氮降解率。

1.6分析方法采用納氏試劑光度法測定氨氮濃度，酚二磺酸光度法測定硝酸亞濃度，N－奈基－乙二胺光度法測定亞硝態(tài)氮濃度。取菌液樣品5mL，6000r/min離心5min，取1mL上清液測定，按公式氮降解率=C0－C1/C0×100%計(jì)算氮降解率，C0為初始氮濃度，C1為殘留氮濃度。

2結(jié)果與分析

2.1氨氮降解菌篩選與鑒定松花江水經(jīng)富集和分離，采用納氏試劑平板法篩選，獲得8株氨氮降解菌(圖1)，菌株WSW－1001半透明圈直徑最大為15mm。該菌株菌落白色、圓形、光滑，邊緣整齊，菌體短桿狀，大小0.2～0.4μm×1.0～1.3μm。革蘭氏陰性，好氧，氧化酶陽性，接觸酶陽性，精氨酸雙水解酶陽性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P陰性，M.R陰性，液化明膠。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小1400bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的Pseudomonas.fluorescensp1－1同源性為99%(圖3)。BIOFOSUN微生物鑒定分析系統(tǒng)分析結(jié)果表明該菌株與熒光假單胞桿菌聚為1組(圖2)。結(jié)合菌株WSW－1001的形態(tài)學(xué)和生理生化特性，以及16SrDNA序列分析和BIOFOSUN微生物鑒定系統(tǒng)分析結(jié)果，菌株WSW－1001被鑒定為熒光假單胞桿菌Pseudomonasfluorescens。

2.2菌株低溫氨氮降解能力菌株WSW－1001低溫氨氮降解效果見圖4。菌株在8℃條件下具有較強(qiáng)的脫氮能力，48h內(nèi)，隨著菌體的生長，氨氮濃度持續(xù)下降，24h對初始氨氮濃度為5.23mg/L的氨氮降解率為71.7%，48h的降解率為80.4%，脫氮過程中無亞硝態(tài)氮積累，有少量(約0.48mg/L)硝態(tài)氮產(chǎn)生。

2.3菌株的異氧反硝化能力菌株WSW－1001在以硝酸鉀為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長與硝態(tài)氮含量變化情況見圖5。菌株在8℃條件下能夠利用硝態(tài)氮生長，24h對初始5.03mg/L硝態(tài)氮的降解率為3討論納氏試劑光度法是測定氨氮常用方法，納氏試劑與氨氮反應(yīng)生成黃棕色絡(luò)合物，顏色深淺與氨氮濃度成正比。固體平板中的氨氮被微生物降解后不能與納氏試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，因此可以通過菌落周圍半透明圈大小定性測定固體平板上生長的菌株氨氮降解能力。本研究采用納氏試劑平板法可以對氨氮降解菌進(jìn)行快速初篩。細(xì)菌的鑒定方法包括傳統(tǒng)方法、分子生物學(xué)鑒定和儀器自動(dòng)化鑒定，每種方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，三種方法結(jié)合可以確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。國內(nèi)外對于異氧硝化細(xì)菌的研究報(bào)道較多，多數(shù)菌株在常溫下脫氮效率較高，辛玉峰等報(bào)道不動(dòng)桿菌YF14在30℃培養(yǎng)3d，可去除92%的氨氮，邱曉帆等報(bào)道1株假單肥菌WSH1001在20～35℃培養(yǎng)9h，氨氮去除率達(dá)95%。對于低溫菌的研究報(bào)道較少，本文報(bào)道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報(bào)道。ZhangD等人報(bào)道從松花江水中分離出1株異氧硝化細(xì)菌MicrobacteriumspSFA13，5℃培養(yǎng)30h后對5.09mg/L初始氨氮的降解率為63.6%;ZhangJ等人報(bào)道PseudomonasstutzeriYZN－00110℃培養(yǎng)2d氨氮降解率為45.5%。本文報(bào)道的菌株WSW－1001低溫氨氮降解能力高于已有報(bào)道。

異氧硝化細(xì)菌的脫氮途徑因菌株而異。菌株WSW－1001在氨氮降解過程中檢測到少量硝態(tài)氮和微量亞硝態(tài)氮，說明該菌株能夠通過硝化作用去除氨氮。該菌株能夠利用硝酸鹽生長，而且能夠檢測到微量亞硝酸鹽生成，說明菌株具有反硝化功能，由于沒有對菌株代謝過程中與硝化和反硝化作用相關(guān)的生化酶進(jìn)行檢測，也沒有對氨氮降解后的最終產(chǎn)物進(jìn)行檢測，因此不能明確該菌株的脫氮途徑。菌株WSW－1001的脫氮效率與菌株的生長速度有關(guān)，生長速度越快，氨氮降解率越高。菌株生長初期，氨氮降解效率較低，降解的氨氮主要用于菌株生長，隨著菌株生長，產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)，對氨氮進(jìn)行生物降解。

作者：張淑梅姜威李晶孟利強(qiáng)曹旭陳靜宇趙曉宇張?jiān)坪挝唬汉邶埥】茖W(xué)院微生物研究所黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院