大豆異黃酮的蛋白功能研究范文

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《現代食品科技雜志》2014年第七期

1材料與方法

1.1原料低溫脫脂豆粕，山東禹王實業有限公司；純天然大豆異黃酮（>40%），陜西禾博天然產物有限公司；β-葡萄糖苷酶（1200U/g），日本Amano公司。苷元型大豆異黃酮，純天然大豆異黃酮經β-葡萄糖苷酶水解制備，其它試劑為分析純或色譜純。

1.2主要儀器設備Mastersize2000粒度分布儀，英國Malvern公司生產；手提式高溫滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司生產；T25高速剪切機，德國IKA公司生產；RapidNcube-杜馬斯定氮儀，法國Elementar公司生產；2501PC-紫外-可見分光光度計，日本島津公司生產；CR22G-型冷凍離心機，日本HITACHI公司生產；LeicaTCSSP5激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司生產。

1.3試驗方法

1.3.1富含異黃酮大豆蛋白的制備采用Wang等[10]的方法，以低溫脫脂豆粕為原料，采用堿溶酸沉技術提取制備大豆分離蛋白（SPI）。純天然大豆異黃酮配置成濃度為40mg/mL的體系，再經β-葡萄糖苷酶（1200U/g）水解后制備成苷元型的大豆異黃酮原液。稱取一定量的大豆分離蛋白，分別配制成pH2.0~7.0的濃度為2%(m/V)的分散液，9000r/min離心30min后，按照每4mL2%SPI加入0.05mL異黃酮的比例分別加入糖苷型大豆異黃酮及苷元型大豆異黃酮，并于常溫充分混合，混合的樣品于高壓鍋120℃處理15min，加熱后取出充分混勻后冰浴降至室溫，加熱的樣品記為SPIG（加入了糖苷型異黃酮）和SPIA（加入了苷元型異黃酮），2%蛋白直接高壓鍋處理記為HSPI。

1.3.2起泡性根據夏寧[11]等報道的方法，略有改動。量取100mL1%蛋白溶液，高速分散均質機以5000r/min的條件均質2min，快速移至250mL量筒內，記錄本次泡沫所占的體積并記為V0，依此評估該蛋白溶液起泡能力大小。將裝有該蛋白溶液的量筒于30℃水浴靜置30min后記錄泡沫的殘留體積Vr。泡沫穩定性=(Vr/V0)×100%

1.3.3持水性(WHC)[11]1%(m/V)的蛋白溶液5mL移入10mL離心管（已稱重），經離心（5000g，30min）后除去上清，稱量離心管的質量，蛋白的持水能力（WHC）按照如下公式計算：21WHC/%=(m-m)100/m其中m1為離心管的質量，單位g；m2為去除上清液后離心管的質量，單位g；m為離心管中蛋白質的質量，單位g。

1.3.4溶解度取不同pH的1%的富含異黃酮的大豆蛋白，分散均勻后采用1mol/L的NaOH溶液調節pH為2.0~10.0。經過離心（9000g，30min）后，取上清液測定蛋白質含量。本實驗中溶解度記為上清液中的總蛋白含量與樣品中的總蛋白含量的比值。凍干后的SPI、Mix、SPIG6.4粉末于0~500℃條件下進行熱重分析以比較失重及分解溫度。

1.3.5乳液的制備[11~12]為研究中性（pH7.0）條件下加入異黃酮前后大豆蛋白在常溫及高溫處理后制備的乳液的性質，取大豆分離蛋白（SPI）、熱變性大豆分離蛋白（HSPI）、常溫混入糖苷型和苷元型異黃酮的大豆蛋白（Mix-SPIG和Mix-SPIA）和熱變性富含純天然大豆異黃酮和苷元型異黃酮的蛋白（SPIG和SPIA），溶液相中分別加入玉米油相(最終的乳液中含有20%（V/V）的玉米油和1%的大豆蛋白。充分混合后經預均質（5000r/min，2min）后，進行高壓微射流處理（50MPa），向所制備的乳液中加入0.02%（m/V）NaN3以抑制微生物的生長。

1.3.6乳液平均粒徑的測定采用MalvernMastersizer2000激光粒度儀測定乳狀液滴的粒徑大小。實驗中采用顆粒折射率為1.520、顆粒吸收率為0.001以及分散劑折射率為1.330（水）的參數進行測定。表面平均粒徑d32與體積平均粒徑d43表征乳液粒度的大小。三次重復測定。

1.3.7乳液的微結構[11]取40μL熒染燃料（0.02%尼羅紅和0.1%尼羅藍混合液）加入1mL乳液樣品中，充分混合后吸取樣品置于帶有凹槽的玻璃載玻片上，載玻片固定于載物臺后再用100×物鏡粗調聚焦平面。選取488nm的Ar離子和633nm的He/Ne離子雙通道激光模式采集圖像，掃描密度設置為1024×1024。采用LASAFLite軟件對圖像處理。1.4統計分析數據一般為三次測定的平均值，并采用SPSS軟件的一維方差分析的LSD比較樣品平均值之間的差異顯著性。

2結果與討論

2.1蛋白的制備不同pH條件下SPI、HSPI及加熱制備的富含純天然大豆異黃酮及苷元型異黃酮的大豆蛋白實物圖如圖1。

2.2溶解度圖2為大豆異黃酮、SPI、HSPI、富含純天然大豆異黃酮的大豆蛋白及富含苷元型的大豆蛋白的溶解度-pH曲線。圖2中的實物圖為大豆異黃酮在水中的溶解狀態，由箭頭所指可見異黃酮在水中溶解度較低。異黃酮結合蛋白后，形成的復合物具有了類似于蛋白的溶解特性。即幾種蛋白在pH2.0~pH10.0的條件下，溶解度曲線都呈現馬蹄形。在等電點附近即pH4.0~5.0的條件下，幾種蛋白的溶解度都是最低；而在高pH即pH8.0和pH10.0的條件下，溶解度呈增加趨勢。幾種大豆蛋白在堿性條件下溶解性良好。富含異黃酮的大豆蛋白的溶解性低于SPI和HSPI，中性pH條件下的富含純天然大豆異黃酮的蛋白溶解性優于富含苷元型的大豆異黃酮的溶解性。大豆蛋白加熱后疏水集團暴露，在一定程度上可能增加了大豆蛋白與異黃酮的結合能力，從異黃酮的結構來看，苷元型的異黃酮為幾種純天然大豆異黃酮去糖苷基形成，即為更加疏水的異黃酮類型，從而導致加熱后的蛋白聚集體中結合了更多的苷元型的異黃酮，蛋白-異黃酮復合物的形成及蛋白純度下降可能是富含異黃酮大豆蛋白溶解度變化的原因，此機理有待進一步驗證。

2.3起泡性SPI、HSPI和富含異黃酮的大豆蛋白的起泡性如圖3所示。蛋白質的起泡能力應用食品體系中能增加產品的體積也可以起到酥松的作用[11]。大豆蛋白質分子因為具兩親性結構而在分散液中表現出較強界面活性，急速機械攪拌時大量氣體混入，溶液中的蛋白質分子吸附到水-空氣界面上，降低界面張力，促進界面形成。同時由于大豆蛋白部分肽鏈在界面上伸展開來，并通過肽鏈間相互作用，形成一個二維保護網絡而使界面膜得以加強，從而促進泡沫的形成與穩定[13]。從圖3a可知，同SPI相比，加熱后處理的幾種蛋白的發泡能力都有所提高，其中HSPI的發泡能力為172.01±0.66%，強于其它幾種蛋白，同時，從圖3b可知，加熱后蛋白樣品的泡沫穩定性相比于SPI有所降低，一方面異黃酮中的糖的存在可能提高粘度，可以一定程度的提高泡沫的穩定[13]，同時加熱處理的過程會導致蛋白溶液粘度降低，繼而排液速率加快，最終使得泡沫穩定性下降。

2.4持水性富含異黃酮大豆蛋白的持水能力如圖4所示。蛋白質的肽鏈上的親水集團與水的相互作用對于蛋白質的持水性有重要關系[11]。本研究中SPI的持水能力約為590.00±3.45%，加熱處理及加入異黃酮后大豆蛋白的持水能力下降，同時pH6.4處加熱制備的富含苷元型異黃酮的大豆蛋白（SPIA6.4）的持水能力最低，即521.56±3.67%，這可能與加熱處理導致的蛋白的徹底變性和疏水集團的暴露以及苷元異黃酮的疏水能力有關。

2.5乳化性SPI、HSPI及富含異黃酮大豆蛋白的乳化特性及乳液的微觀結構如圖5和圖6。對于新鮮乳液測定的d43，SPI的粒度為1.35±0.12μm，混合純天然大豆異黃酮及苷元型異黃酮的蛋白的乳液粒度分別為25.41±1.32μm和24.57±1.73μm。加熱后的SPI及SPIG、SPIA的粒度分別為32.14±0.21μm、38.99±0.89μm和34.50±0.48μm。試驗條件下，同天然分離蛋白和混合添加異黃酮的蛋白相比，加熱法富含異黃酮的蛋白制備的乳液的粒度增大，離心處理后穩定系數有所降低，但該乳液具有更加良好的塑性，與HSPI呈現相似特性，可見熱處理對蛋白乳液特性具有重要影響，這與文獻報道的結論一致[14]。對于乳液粒度的增大，一方面可能由于高壓乳化時首先促進了蛋白質聚集體在界面上的吸附，后因蛋白質聚集體的空間位阻作用，蛋白質分子最終難以完整的覆蓋油滴，油滴的再次聚結被阻止，因而加熱后的聚集體都出現了較大的液滴[12]；另一方面，大豆異黃酮的加入首先形成了大豆蛋白-異黃酮復合物，加熱制備后形成了粒徑更大的可溶性聚集體顆粒（圖A），由于純天然大豆異黃酮帶有糖側鏈，且比苷元型的異黃酮具有更大的分子量，因而形成了幾種乳液的粒度差異。圖中A-F分別為SPI、Mix-SPIG、Mix-SPIA、HSPI、SPIG和SPIA形成的乳液。由圖可知，染色后的乳液的微結構可通過激光共聚焦顯微鏡觀察。經過加熱處理后的蛋白（包括加入異黃酮的）都出現了相對較大粒度的油滴，直接混合未加入異黃酮的大豆蛋白乳液比加入異黃酮加熱處理的蛋白的油滴較小（圖6），該結論與粒度測定的結果相一致。

3結論

本文以SPI與大豆異黃酮為原料，制備了不同pH、不同溫度、不同大豆異黃酮類型等條件下的富含異黃酮的大豆蛋白，并考察了各種蛋白的功能性。研究表明，優化的pH條件制備的蛋白可以實現對難溶性的大豆異黃酮的增溶，加熱處理對于所制備的蛋白的功能性具有重要的作用。富含異黃酮的大豆蛋白具有相對良好的起泡性、泡沫穩定性、持水性及溶解性，富含純天然大豆異黃酮的大豆蛋白的持水性、發泡能力、溶解性略優于同原料制備的富含苷元型異黃酮的大豆蛋白。同SPI及混合了異黃酮的大豆蛋白相比，加熱后蛋白所制備的乳液粒度增大、離心后乳液穩定系數降低，但相對于天然大豆蛋白，加熱后的蛋白制備的乳液具有更加良好的塑性。該蛋白的制備對大異黃酮的增溶及富含異黃酮的功能性飲料的研究提供一定基礎。

作者：楊娟王成根彭捷楊曉泉單位：華南理工大學輕工與食品學院