鋅離子響應水凝膠的制備范文

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《中國科技論文雜志》2015年第二十二期

摘要：

為了制備含有咪唑基團的水凝膠，本文將反應制備的Im－PAA－HEAA大分子單體和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）混合，在紫外照射下發生自由基反應，從而得到Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠。在低濃度的鋅離子溶液刺激下，水凝膠表現出體積收縮、吸水率下降和強度增強等響應性，并且表現出良好的細胞相容性。將尿刊酸接枝于聚乙烯亞胺（PEI），制成含咪唑的非病毒基因載體（Im－PEI），該載體可以有效復合pDNA，并具有低細胞毒性和較高的轉染效率。利用鋅離子和咪唑之間的絡合作用，可以將Im－PEI／DNA復合物有效地固定于Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠表面。研究結果表明：與無鋅離子作用相比，Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子作用下能夠吸附更多的Im－PEI／DNA復合物，該水凝膠有望在反向基因轉染方面得到應用。

關鍵詞：

水凝膠；咪唑；鋅離子響應；基因轉染

水凝膠是通過化學或物理交聯使親水聚合物鏈聚集而形成的三維網狀結構［1］，可以迅速吸收并保持大量水分，而又不溶于水，是集吸水、保水、緩釋于一體的功能高分子材料。圖1為水凝膠的網絡示意圖［2］。水凝膠因兼具高含水量與活動性，結構類似于生物體，表現出優良的生物相容性，可應用于組織工程、藥物傳遞、生物傳感器等領域［3－4］，其中在生物領域應用更加廣泛，反向基因轉染就是一個重要方面的應用。目前，對于一些對人類健康構成嚴重危害的疾病，如心血管疾病，惡性腫瘤，感染性疾病（如艾滋病）和遺傳性疾病（如先天免疫缺陷、血友病）等，醫學上傳統治療方法存在很大的局限性，與之相比，基因治療有著極大的優勢。1989年，科學家成功將腺嘌呤脫氨酶（ADA）基因導入患者體內的T淋巴細胞，治療了ADA基因缺失病，標志著基因治療時代的開始。基因治療要求基因運輸系統有效、可控，涉及材料科學、生命科學、臨床醫學等多學科領域。基因治療最關鍵的環節是選擇基因轉染所用的載體，它是將用于治療的目的基因輸送到病患體內靶細胞的工具，分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體的轉染效率非常高，但目的基因的攜帶量小，基因與載體組裝的難度大、成本高，轉染可控性差，具有高自身免疫原性和潛在致癌危害性，還有造成細胞病理改變的可能，因而其應用受到了很大限制。非病毒載體不含病毒基因和蛋白成分，所以不具有病毒載體的高自身免疫原性和潛在致癌性，且具有基因容量大、化學結構可設計控制，以及大量制備方便、成本低等優點，引起學界越來越多的關注。

非病毒載體有陽離子脂質體、陽離子高聚物和多功能納米材料等。非病毒載體進行基因轉染的普遍的方法是陽離子高聚物或脂質體通過與DNA的靜電作用形成納米級復合物。將裝載有目的基因的復合物溶液加入到細胞培養基中，復合物沉淀到貼壁細胞的表面，由宿主細胞通過胞吞作用吸收目的基因，之后目的基因所含DNA在細胞內表達。這種方法需要控制較低的復合物溶液濃度，否則生物相容性差，會表現出毒性。而且復合物在溶液中處于流動狀態，比較分散且不在固定位置，復合物與靶細胞的接觸機會受到限制。這些都造成非病毒載體的轉染效率低，因此提高轉染效率是非病毒載體應用的關鍵。為了解決上述問題，近年來提出了一種反向轉染（reversetransfection）方法，用固態材料吸附DNA或載體／DNA復合物，讓其與靶細胞的溶液接觸，實現轉染。這種方法的轉染過程在固定位置進行，可以實現目的基因在靶細胞所處的位置原位釋放。而且靶細胞接觸的目的基因量比較大，接觸機會和轉染效率得到提高［5］。Shen等［6］將DNA沉積到無機礦物質表面制成復合物納米材料，材料表面能夠提供生物相容性好的環境，DNA濃度也高。轉染效率可以通過調節無機礦物質的組分來調節，最佳轉染效率可以與市面上出售的化學藥劑的商品化脂質體相當。Rea等［7］以載體／DNA復合物吸附蛋白進行轉染，并經過研究發現蛋白的種類影響載體復合物的固定和進入細胞后轉運的途徑，表面吸附蛋白可以促進細胞內吞作用，提高轉染效率。水凝膠是一種適合作為反相轉染的介質，對基因轉染用水凝膠的研究也開展得比較多。

Segura等［8］合成了一種可降解的透明質酸／膠原基水凝膠，能夠通過物理作用和生物素結合作用，吸附PEI載體／DNA復合物，進行反相基因轉染，并且能夠實現控制釋放。這種凝膠還可以設計固定的圖案，將圖案以外的部分遮蔽，使靶細胞在與凝膠接觸時沿圖案的方向生長，并沿這一方向在固定的區域內被轉染。Rieux等［9］使用2種方法進行纖維蛋白原水凝膠介導基因轉染：方法1，先將脂質體復合物和細胞培養30min，再加入到纖維蛋白原中混合并聚合；方法2，脂質體復合物直接與纖維蛋白原混合聚合，再將細胞接種到制成的凝膠的表面。經過分析研究，類似反向轉染原理的方法2能夠延長目的基因對靶細胞的表達時間，并且具有控釋作用。以上研究表明，水凝膠適宜作為基因轉染所用的固態生物材料，前景非常廣闊。水凝膠如用作基因轉染材料，要求其能夠對DNA或載體／DNA復合物通過氫鍵或化學鍵等作用形成良好的吸附。智能水凝膠在響應刺激的情況下可以改變自身強度，在網絡結構中引入新的化學鍵，為凝膠－載體－DNA的基因轉染材質體系提供設計思路。

1Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠的制備與表征

水凝膠可以通過物理交聯和化學交聯制備。其中，采用物理交聯法制備的水凝膠的力學性能比較差，而化學交聯水凝膠則能夠克服這一缺陷［1］。一般來說，高分子主鏈或側鏈上含有大量的親水基團和具有適當的交聯網絡結構是制備水凝膠的必要前提條件［10］。聚丙烯酸（PAA，相對分子質量為800）與N，N′－羰基二咪唑（CDI）和N－羥乙基丙烯酰胺（HEAA）反應制成Im－PAA－HEAA大分子單體，此大分子單體和PAA單體的1HNMR譜圖如圖2所示，從中計算得到HEAA的接枝率約為20％。以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，相對分子質量4000）為交聯劑，2－羥基－4－（2－羥乙氧基）－2－甲基苯丙酮（Ir－gacure2959）為光引發劑，通過紫外光引發制成了大分子單體質量分數為10％、15％、20％的Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠。平衡含水量是水凝膠的重要基本指標之一，文中不同單體比例水凝膠的平衡含水量如圖3所示。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠的含水量很高，在磷酸緩沖鹽溶液（PBS）環境中，單體比例（質量分數）為10％的水凝膠含水量可達92．13％（質量分數），而隨著大分子單體含量的增加，水凝膠的含水量略有下降。這是由于在聚合的過程中，較高的大分子單體濃度會導致較高的大分子網絡密度，從而阻礙水向凝膠中擴散，溶脹情況受到網絡密度的影響。由于咪唑和鋅離子的作用，鋅離子處理后的水凝膠使網絡更緊湊，網絡密度增大，含水量比鋅離子處理之前減少，單體比例（質量分數）為20％的水凝膠在經過鋅離子處理后，平衡含水量也可以達到87．77％（質量分數）。不同單體比例的水凝膠經鋅離子處理后的體積變化情況如圖4所示，微量鋅離子可以使水凝膠的體積收縮，鋅離子濃度越高，水凝膠收縮越快。低濃度（10mmol／L）鋅離子可以分別使單體比例為10％、15％和20％的水凝膠體積收縮至原體積的55％、62％和67％。單體濃度增加雖然使進入的鋅離子與咪唑作用點和絡合鍵更多，但是凝膠本身的網絡密度也增大，具有一定剛性的PAA主鏈增多，網絡結構更穩定且不易改變，絡合作用使網絡變緊湊。因此，單體比例為20％的水凝膠的網絡密度增大的比率較單體比例為10％的水凝膠的小，因此隨單體比例的增加，水凝膠的體積變化程度減小。經過5mmol／L的ZnCl2溶液浸泡1d之后，單體比例為10％、15％、20％的水凝膠的壓縮強度如圖5所示，圖中數據表明凝膠的壓縮強度由鋅離子處理前的0．05、0．08、0．11MPa分別提高到鋅離子處理后的0．135、0．145、0．26MPa。這些結果表明，在鋅離子的作用下，水凝膠的壓縮強度有了大幅度的提高。水凝膠中的咪唑環和鋅離子有很強的結合作用，形成了絡合鍵，增加了交聯點，可以抵抗外界作用力，水凝膠的壓縮強度因此得以提高。單體濃度越高，形成絡合作用越強，交聯點越多，水凝膠的壓縮強度增大得越多。在水凝膠表面接種細胞，培養生長，之后用含5mmol／L鋅離子的溶液浸泡4h，與對照組進行對比，觀察細胞在水凝膠表面的生長情況。圖6表示細胞在水凝膠表面的黏附情況，圖中可以看到2組細胞都可以很好地在水凝膠表面生長，說明Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子響應前、后都具有比較好的生物相容性。

2Im－PEI載體／pDNA復合物水凝膠的制備及反向轉染應用

聚乙烯亞胺（PEI）是一種使用較多的陽離子高聚物非病毒載體，在1995年由Boussif等［11］研究報道。PEI在生理環境下就能質子化而帶正電荷，吸附、包裹帶負電荷的DNA。PEI具有“質子海綿”特性，靶細胞通過胞吞作用吸收載體／DNA體系，載體／DNA體系在胞吞作用下進入內涵體、溶酶體。在內涵體／溶酶體中，PEI能夠吸附大量氫離子導致氯離子滲入引發內涵體溶脹甚至破裂，使PEI／DNA能夠逃逸出來，實現表達而不會被降解［12］。用尿刊酸與CDI和PEI反應，合成的Im－PEI的核磁氫譜如圖7所示，1HNMR譜圖證明制成了接枝有咪唑基團的Im－PEI載體，該載體在復合pDNA后，可以通過鋅離子的作用被水凝膠吸附從而進行反向轉染實驗（如圖8所示）。pDNA分子為兩性電解質，在中性或偏堿性條件下，pDNA的磷酸基團電離使核酸分子帶負電荷，從而在外加電場中向正極泳動。由于PEI分子中含有大量氨基，使其帶有正電荷，當向pDNA中加入PEI或Im－PEI時，隨著加入量的增大，載體和pD－NA之間會通過庫倫相互作用而發生坍塌縮合，電荷發生中和，阻礙pDNA向電解池陽極移動，根據阻礙程度，可以判斷出電荷中和程度，間接反映出載體對pDNA的復合能力。載體對pDNA的有效復合將有利于pDNA在基因轉染過程中的穩定運載，同時保護pDNA免受核酸酶的降解，從而提高基因轉染效率。由圖9復合物與裸pDNA的電泳條帶長度可以看出，當載體與pDNA質量的比值大于0．4時，兩者復合可有效形成復合物，Im－PEI載體有利于pDNA免受降解而穩定運載，載體與pDNA的復合能力隨載體與pDNA比例的增大而略有增強。圖10為MTT法評價合成的Im－PEI載體的細胞毒性結果圖。結果表明，Im－PEI載體生物相容性良好，載體與pDNA質量比為2∶1和4∶1的復合物細胞存活率要高于純PEI載體／pDNA復合物，接近90％，載體與pDNA質量比為6∶1和8∶1時細胞存活率有所降低，但也都在70％以上。圖11為熒光素酶報告基因評價載體的轉染效率結果圖，Im－PEI載體能夠有效地轉染細胞。但與作為對照的PEI相比，Im－PEI載體的轉染效率稍低，其中載體與pDNA的比值為8∶1時的轉染效率最高（如圖11所示）。綜合考慮上文的生物相容性檢測結果，以及為使載體能夠高效地與鋅離子作用從而被凝膠吸附需要咪唑有較高含量，載體與pD－NA之比為8∶1時是最為合適的選擇。通過熒光顯微鏡觀察在濃度為0．5mmol／L鋅離子的浸泡下，水凝膠吸附Im－PEI載體與綠色熒光標記的pDNA復合物的情況，如圖12所示。沒有鋅離子存在的情況下，水凝膠與載體／pDNA復合物之間沒有比較強的化學鍵或作用力，復合物難以在水凝膠表面附著，即使暫時停留在水凝膠表面也很容易脫落，因此，由圖12（a）可見，復合物在水凝膠表面的吸附量很少。而同時加入鋅離子與復合物，使鋅離子與水凝膠或復合物上的咪唑環發生絡合作用，且鋅離子和兩者絡合的機會接近均等，絡合鍵同時聯結水凝膠與復合物的幾率很大，也就使水凝膠能吸附大量的載體／pDNA復合物，所以通過熒光顯微鏡能夠觀察到很多綠色光點，在圖12（b）中的黑白圖中表現為白色亮點。這一結果表明，本文制備的這種水凝膠有作為基因轉染固態材料應用的潛力。

3結論

本文制備了Im－PAA－HEAA大分子單體，并通過光引發制成了該大分子單體質量分數為10％、15％和20％的鋅離子響應水凝膠。單體含量的增加可以使凝膠中交聯網絡密度增大，網絡結構更趨穩定，因此水凝膠的強度會隨著大分子單體濃度的增加而增加。水凝膠經過低濃度的鋅離子浸泡處理后，由于鋅離子與咪唑基團的作用，水凝膠體積收縮、吸水率降低、力學性能增強，其中單體質量分數為10％的水凝膠收縮率最高，單體質量分數為20％的水凝膠力學性能最強。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠具有良好的生物相容性，細胞能夠在凝膠表面生長。制備的基于Im－PEI的非病毒載體，可以有效地復合pDNA，兼具低毒和高轉染效率。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子作用下，能夠吸附大量的Im－PEI／pDNA復合物，有望作為反向基因轉染的載體。

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作者：宋俊飛 石成望 王瑋 單位：天津大學材料科學與工程學院