醋蛋抗氧化肽思考范文

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《中國調(diào)味品雜志》2014年第七期

1醋蛋液酶解反應(yīng)

1．1酶的篩選實驗本試驗選用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，在各酶最適pH、溫度、相同的添加量（E／S）對醋蛋液進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解物的DPPH•自由基清除率作為篩選最佳蛋白酶的指標(biāo)。

1．2胃蛋白酶酶解醋蛋的單因素試驗在酶解過程中，pH值、溫度、時間和酶濃度對反應(yīng)速度影響較大，通過實驗確定適當(dāng)?shù)膮?shù)才能獲取高活性的酶解產(chǎn)物。由于每一種酶都具有最適宜的pH值和溫度范圍，故本實驗以DPPH•自由基清除率為指標(biāo)對酶的添加量、酶解時間及底物濃度進(jìn)行單因素分析，確定影響胃蛋白酶解的三個因素最適作用條件。

1．3酶解反應(yīng)的正交試驗考慮底物濃度、酶量和反應(yīng)時間這3個因素，各因素水平見表1和表2。

2結(jié)果與分析

2．1蛋白酶活力

2．1．1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作首先以DL－酪氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用最小二乘法得到DL－酪氨酸濃度X（1μg／mL）與吸光度Y（OD680）之間的回歸方程為：x＝100y－0．87。該方程R2＝0．9997，比色常數(shù)K＝100，符合酶活力測定的要求。酪氨酸溶液濃度與吸光值的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2．1．2酶活力測定采用福林酚法酶促反應(yīng)10min，測定不同蛋白酶的樣品的吸光值，通過酶活計算式算出的5種蛋白酶的活力見表3。由表3中酶活數(shù)據(jù)可知，各種蛋白酶的酶活力具有較大差異，這是因為不同來源的蛋白酶其酶學(xué)特性不同，而且酶作用位點的專一性不同，針對相同的底物，其酶活力會有差異。研究表明：動物蛋白比植物蛋白容易酶解，而植物蛋白質(zhì)中存在阻礙酶作用的結(jié)構(gòu)，限制蛋白酶解，所以要對醋蛋白的水解用酶進(jìn)行篩選，篩選出酶解產(chǎn)物抗氧化活性強、水解效率高的酶制劑。

2．1．3蛋白酶的篩選在醋蛋水解過程中蛋白酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后產(chǎn)品的得率、反應(yīng)速度，而且直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和理化特性。蛋白水解物的生理活性取決于所用原料醋蛋的氨基酸序列、蛋白酶種類和醋蛋水解度的大小。本試驗選取胃蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對醋蛋液進(jìn)行水解反應(yīng)，以此來比較酶種類對醋蛋液作用的差異。不同蛋白酶對醋蛋液水解度的影響：在4種蛋白酶的最適溫度、最適pH值條件下酶解10h，相應(yīng)的酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g、底物濃度［S］為1％。不同蛋白酶對醋蛋液水解度的影響見圖2．由圖2可知，在酶解約480min后，醋蛋液的Al－calase酶解物、胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物的水解度分別達(dá)到其最大水解度的1／2，而木瓜蛋白酶酶解物對醋蛋液的水解作用很小。原因是蛋白酶酶學(xué)特性不同、來源不同，水解作用差異較大。在4種酶的酶解進(jìn)程中，因為Alcalase堿性蛋白酶和胃蛋白酶的酶活力高、溶解性好、專一性強等特點，所以水解過程比較理想。

2．1．4醋蛋液的不同蛋白酶水解物對二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）的清除能力在酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g、底物濃度［S］為1％，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶4種蛋白酶各自的最適條件下水解8h，反應(yīng)結(jié)束后，檢測產(chǎn)物對DPPH•的清除率，結(jié)果見圖3。由圖3可知，4種蛋白酶的水解物都具有體外抗氧化作用，其中抗氧化作用最強的是胃蛋白酶酶解產(chǎn)物，其次是堿性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解物。由此可見，醋蛋液經(jīng)4種蛋白酶水解后都具有體外抗氧化活性的肽段，但各種酶的特異性肽段的種類和數(shù)量不相同，因而具有不同的體外抗氧化活性。由試驗結(jié)果可以看出，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物對DPPH•的清除能力較強，在醋蛋的酶解過程中具有較高的酶活力和穩(wěn)定性。而疏水性氨基酸－COOH是堿性蛋白酶的切割位點，這就造成它酶解產(chǎn)物中會產(chǎn)生很多游離的疏水性氨基酸和末端為疏水性氨基酸的多肽，使得水解液苦味最大。而胃蛋白酶水解多肽的苦味程度較小，疏水性氨基酸從肽鏈中部移向末端，使苦味有所減弱，另外選擇胃蛋白酶作為醋蛋液的水解用酶是模擬人體生物酶，成本低、來源廣泛，適于工業(yè)化生產(chǎn)中使用，因此確定醋蛋液的最佳水解用酶為胃蛋白酶。

2．2胃蛋白酶單因素試驗結(jié)果分析

2．2．1底物濃度對醋蛋液抗氧化性的影響胃蛋白酶在酶與底物之比為8000U／g、反應(yīng)時間8h、pH2．0、溫度37℃的條件下，分別對底物濃度為0．8％，1．5％，2．0％，2．8％的醋蛋溶液酶解，測定酶解產(chǎn)物對DPPH•的清除率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，底物濃度在0．8％～2．8％范圍內(nèi)的醋蛋液抗氧化活性變化情況，酶底物濃度較低時清除率較小，隨著底物濃度的增加，抗氧化性呈現(xiàn)上升的趨勢。當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?．0％時，酶底物濃度再增加，抗氧化性基本不變，可能是由于醋蛋液的濃度過大比較黏稠、粘度增大，降低了酶解液的水分活度，影響蛋白酶擴散，對水解反應(yīng)有抑制作用，所以底物濃度取值范圍為1．5％～2．8％，這樣可以提高酶解效率。

2．2．2酶用量對醋蛋液抗氧化性的影響由圖5可知，酶用量在8000～14000U／g范圍內(nèi)醋蛋液抗氧化性變化情況，隨著酶用量的增加，抗氧化性呈現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)酶用量為8000U／g時，醋蛋液抗氧化性達(dá)到最高。在底物濃度一定的條件下，濃度越大則酶與底物之間作用幾率越大、越頻繁，當(dāng)酶量的增加使酶的數(shù)量過剩時，單位時間內(nèi)多余的酶分子不與底物結(jié)合，水解程度增加在圖表上表現(xiàn)變平緩的趨勢。另外，酶本身是一種蛋白質(zhì)，酶解底物的同時自身也會發(fā)生酶解，酶用量太大會干擾酶解物的生成。從成本上考慮，酶試劑價格較貴，過量添加成本較高。因而，在酶解時選擇最佳的酶用量為6000～10000U／g。

2．3正交試驗設(shè)計優(yōu)化工藝流程根據(jù)單因素的最適水解條件，底物濃度（1．5％～2．8％），酶與底物濃度比（6000～10000U／g），研究酶底物比、底物濃度對酶解產(chǎn)物抗氧化性的影響，通過單因素試驗確定取值范圍。以酶解產(chǎn)物對DPPH•的清除率為指標(biāo)，選用三因素三水平正交組合，以確定最佳酶解條件。通過酶解產(chǎn)物對DPPH•的清除率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立DPPH•清除率與底物濃度、酶底物比和酶解時間的數(shù)學(xué)模型，并確定最優(yōu)條件體系下DPPH•的清除率。正交試驗方案結(jié)果見表4。由表4可知，通過回歸正交試驗結(jié)果確定胃蛋白酶的最佳水解條件是A2B2C3，即底物濃度2％，酶底物濃度比8000U／g，酶解時間為8h，實驗數(shù)據(jù)中5號實驗結(jié)果67．1％最高抗氧化數(shù)據(jù)，也正是在A2B2C3酶解條件下所獲得的。

2．4抗氧化性比較在相同條件下，不同的酶解產(chǎn)物抗氧化大小不同，實驗選取醋蛋液水解物、麥胚蛋白水解液和WPI乳清分離蛋白水解物與純品Vc抗氧化性比較，實驗結(jié)果見表5。由表5可知，各種酶解物抗氧化大小不同，其中醋蛋的胃酶酶解的抗氧化性達(dá)到67．10％，證明醋蛋酶解物具有的抗氧化性與其它酶解物相比較高，極具研究價值。

3結(jié)論

本試驗選取兩種動物蛋白酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）、一種微生物蛋白酶（Alcalase堿性蛋白酶）和一種植物蛋白酶（木瓜蛋白酶），對醋蛋液進(jìn)行水解反應(yīng)，以此來比較酶種類對醋蛋液作用的差異及水解效果。在底物濃度［S］為1％、酶與底物的濃度比［E］／［S］為8000U／g，分別在4種蛋白酶的最適溫度、最適pH值條件下酶解10h。實驗結(jié)果表明，胃蛋白酶是醋蛋液的最佳水解用酶。采用二苯代苦味肼基自由基（DPPH•）體系研究各酶水解物的抗氧化活性，確定酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強酶類。實驗結(jié)果表明：4種蛋白酶的水解物均有體外抗氧化作用，但對DPPH•自由基的清除率有較大差異，其中具有較強清除自由基能力的是胃蛋白酶，其DPPH•自由基的清除率高達(dá)61．1％。由此可知，醋蛋液酶解產(chǎn)物具有較強清除自由基能力，即具有良好抗氧化活性。其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強酶類是胃蛋白酶。通過正交試驗確定胃蛋白酶的最佳水解條件：底物濃度2％，酶底物濃度比8000U／g，酶解時間為8h，在此條件下酶解產(chǎn)物對DPPH•的清除率為67．1％。實驗在相同的條件下比較醋蛋液、麥胚蛋白、WPI乳清分離蛋白與純品Vc抗氧化性比較，實驗結(jié)果表明，醋蛋水解物的抗氧化性最高。

作者：陳黎斌劉巖成世盈許曉娜陳自立何國盛單位：廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院