真空采血管對血漿血清多肽質譜的影響范文

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摘要：目的觀察不同添加劑處理的真空采血管留取標本對患者血漿/血清多肽檢測的影響，確立血漿/血清多肽質譜分析臨床適用的采血管。方法招募6名志愿者，男性2例，年齡(28±2)歲；女性4例，年齡(30±3)歲，采集志愿者的靜脈血液樣本放入6種臨床上日常使用的真空采血管，并按采血管的種類分為6組。采用弱陽離子磁珠提取多肽，Clin-TOF平臺進行檢測，通過BioExplorer軟件和SPSS22.0進行多肽峰的比較。結果6組采血管共出峰117個，108個多肽峰具有差異(P＜0.05)，95個具有顯著差異(P＜0.01)，血漿管之間差異峰的數量顯著高于血清管之間；分離膠促凝管正態分布的血清多肽峰最多(110個)，且峰強度大于300的強勢峰出峰數均值最高，標準差最小(27.7±1.97)；根據正態分布多肽峰數、強勢峰出峰均值、全峰強度、強勢峰強度這四個指標進行因子分析，分離膠促凝管得分最高。結論含有分離膠的促凝管是最適用基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜分析的最佳采血管。

關鍵詞：多肽；血漿；基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜；

近年來，質譜技術在生命科學領域發展迅速并廣泛應用，涉及了多個學科。目前常用的質譜技術之一——基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)，因其高靈敏度、高準確度、高通量、易于自動化等特點，為其在檢驗醫學領域的應用提供了廣闊的前景和發展空間[1-3]。質譜技術可用來尋找體內特異的生物標志物，從而對疾病的早期診斷起到獨特高效的篩選作用，達到理想的疾病早期預警目的。質譜技術可以對多種生物樣本進行檢測，其中血液樣本以其取材方便、樣本穩定度高、容易保存等特點更廣泛的應用于臨床。因檢測需要，血液樣本采集常使用添加了不同抗凝劑或促凝劑的真空采血管，對于不同真空采血管對生化指標的影響已有大量報道[4-6]。隨著質譜技術在臨床的推廣應用，相應的分析前實驗條件的摸索應同時開展。本文觀察不同真空采血管中的添加劑對質譜分析的影響，以篩選出對質譜分析效果最佳的真空采血管。

材料和方法

1樣本獲取

招募志愿者6名(男性2名，女性4名)，平均年齡30歲，編號A、B、C、D、E、F。采集每名志愿者6份血液樣本放入6種臨床上日常使用的真空采血管中。按采血管的種類分為6組(第1組為添加枸櫞酸鈉的抗凝采血管，編號A1、B1…F1；第2組為添加EDTA2K的抗凝采血管，編號A2、B2…F2；第3組為添加肝素鋰的抗凝采血管，編號A3、B3…F3；第4組為添加氟化鈉的抗凝采血管，編號A4、B4…F4；第5組為無添加的促凝采血管，編號A5、B5…F5；第6組為添加分離膠的促凝采血管，編號A6、B6…F6)。放置15min后，3000g離心10min后進入質譜分析的前處理流程。

2試劑與儀器

血漿/血清多肽提取和測定為血漿/血清低豐度多肽。主要試劑有多肽提取用的SPE-C磁珠試劑盒(Bioyong，中國)，標準品Peptidecalibrationstandard和標準品ProteincalibrationstandardⅠ(Sigma，德國)，基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)(Sigma，德國)，100%色譜級丙酮和100%色譜級乙醇(J.K.Baker，美國)。主要消耗品包括：96targetsAnchorchip靶(BrukerDalton，德國)，排管(Axygen，美國)，eppendorf管(Axygen，美國)，槍頭(Axygen，美國)，移液器(Eppendorf，德國)，磁架(Bioyong，中國)。檢測儀器為基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)Clin-TOF-Ⅰ(北京毅新博創生物科技有限公司，中國)。

3樣品前處理與質譜分析

血漿多肽提取流程按照試劑盒標準流程操作，血漿質譜分析操作流程按照布魯克道爾頓公司提供的標準操作流程進行。將200μl樣品管置于孔板上，依次加入10μl磁珠，加入95μl磁珠結合緩沖液(CB)，加入10μl血漿樣本，在室溫靜置。將樣品管在磁珠分離器上靜置1min，磁珠富集到管底并貼壁，與懸浮的液體分離，吸去上清的液體。將樣本放入孔板中，加入100μl磁珠清洗緩沖液，吸去上清液體，并重復此步驟，保證上清液完全被吸走。將樣品放置于孔板上，加入10μl磁珠洗脫液(CE)反復吸打，靜置，將上清液移出到已標記的0.2ml的樣品管中待測。Clin-TOF儀器檢測，點靶前對儀器進行校正，點靶方式為覆蓋法，將點好多肽提取物的靶放入Clin-TOF儀器中，點擊激光Shot，累積Shot圖。質譜采用的是線性模式，每個樣本采集50個frofile，每個frofile10個shots，荷質比范圍M/Z1000-10000。所有樣本的累積激光Shot圖用BE軟件和SPSS22.0進行生物信息學分析和統計學分析，尋找鑒定差異峰。

4優選標準

根據正態分布多肽峰數、強勢峰出峰數均值、全峰強度、強勢峰強度進行因子分析和排序，得分最高者為最優采血管。

5統計學處理

應用BioExplorer軟件(Bioyong，中國)和SPSS22.0進行數據分析，血漿/血清多肽峰的正態性檢驗采用AdersonDarlingTest。峰強度和出峰數用-x±s表示，行因子分析和排序。組間差異多肽峰的比較為One-WayAnova+兩兩比較LSD檢驗，或非參數分析KruskalWallisTest。檢驗水準α=0.05。

結果

1血漿多肽峰的正態性/變異分析

6組樣本共出峰117個，同一人的6種真空采血管血漿多肽峰的圖譜形態不同(見圖1)。在117個多肽峰中，符合正態分布的多肽峰最多的為第6組含分離膠的促凝管(110個)，其次為第3組(106個)、第5組(102個)、第2組(95個)、第4組(90個)、第1組(90個)，表明第6組的真空采血管所采集的血漿多肽峰變異最小。

2差異多肽峰分析

117個多肽峰中組間差異峰有108個(P＜0.05)，其中P＜0.01的差異峰為95個。組1~組4為血漿管，組5和組6為血清管。組間兩兩比較，2組和6組之間差異峰數量最多(92個)，5組和6組之間差異峰的數量最少(4個)，見表1。說明在差異峰的數量上，不僅血漿管與血清管之間存在顯著差異，即使是血漿管之間也存在差異，但以血清管之間差異最小，血漿管與血清管之間差異最大。6組中峰強度最大的前10個多肽峰除第3組多肽峰1277.0m/z外(P=0.449)，均為差異峰(P＜0.01)(見圖2)。說明采血管的種類不同也造成了各組強勢峰的顯著性差異。

3強度＞300的強勢峰出峰數比較

應用Bioex-plorer軟件采集每個樣本血漿/血清多肽峰強度＞300的出峰數和強度，比較出峰情況，考察均一性。各組出峰數均值分別為26.7±4.50(1組)，26.3±3.67(2組)，22.7±3.08(3組)，25.7±3.67(4組)，26.3±2.80(5組)，27.7±1.97(6組)，根據每位志愿者的強勢峰出峰情況顯示，第6組均一性最佳(見表2)。各組全峰強度和強勢峰強度比較，相關性較好(見圖3)。

4采血管的選擇

根據正態分布多肽峰數、強勢峰出峰數均值、全峰強度、強勢峰強度這四個指標進行因子分析和排序(見表3)。根據分析結果，第6組含有分離膠的促凝管得分最高，最適合MALDI-TOFMS質譜分析。基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)是近年來發展起來的一種軟電離新型有機質譜，近年來已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強有力工具。其原理是：當用一定強度的激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量，基質-樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測。MALDI-TOF-MS的中心技術就是依樣品的質荷比(m/z)的不同來進行檢測，并測得樣品分子的分子量[7]。本研究中采用磁珠提取血漿/血清多肽，磁珠試劑盒以弱陽性離子交換原理為基礎，采用磁珠在高鹽低pH溶液中特異性吸附生物樣本中的蛋白質多肽，在低鹽溶液中釋放蛋白多肽分子，從而捕獲血漿/血清中的蛋白質多肽，可直接用于基質輔助激光解析電離飛行時間質譜的分析。有研究顯示，血漿與血清中代謝物濃度有明顯差異[8-11]，基于核磁共振的代謝組學研究證明等離子體、EDTA、肝素和枸櫞酸抗凝血劑可以嚴重影響代謝信息的復原[12-13]，本實驗中不同添加劑的采血管在同一條件下獲得的多肽峰出峰圖譜具有顯著差異，這一試驗結果與其他研究相一致。六組樣本共出峰117個，其中組間差異多肽峰共108個(P＜0.05)，說明采血管中的添加劑對多肽峰的檢測具有明顯的影響。原因是抗凝或促凝劑激活的凝血過程不同，蛋白在此過程中的水解片段也不同。凝血與纖溶的平衡是動態的，這一過程是一系列的酶促反應，蛋白酶的連續激活與失活，血小板失活導致凝塊形成，這些都有可能釋放出肽和蛋白質片段[14-15]。我們的實驗結果顯示：第六組含分離膠的促凝管樣本符合正態分布的多肽峰最多(110個)，說明用第六組采血管檢測出來的樣本變異最小，出峰最穩定。在血清中，代謝物的濃度要普遍高于血漿，但兩者仍呈現明顯的相關性[16-17]。Breier等的研究指出，血清中101種代謝物濃度顯著高于血漿，血清中代謝物的可靠性更高[18]。我們的研究同樣發現：血清管的峰強疊加普遍高于血漿管。血清分離膠作為一種惰性半固體，多由聚酯、聚烯烴和丙烯等材料構成，具有抗氧化、耐高溫、抗低溫，高度穩定的特點，并具有很強的觸變性，可在血清和血細胞之間存在固化屏障，保障血清化學成分的穩定。本研究中對峰強度大于300的多肽峰進行比較，第六組出峰均值最大，標準差最小，從累積峰強度來看，第六組雖然略低于第四組和第五組，但明顯高于前三組的血漿管。根據正態分布多肽峰數、強勢峰出峰數均值、全峰強度、強勢峰強度這四個指標進行綜合評價打分，第六組得分最高。綜上所述，含有分離膠的促凝管為最適用于質譜分析的真空采血管。

參考文獻

1張寧，陸學東，吳正林.飛行時間質譜技術在糖尿病腎病患者尿蛋白成分分析中的研究進展［J］.現代檢驗醫學雜志，2016，31（5）：160-164.

6李慧，白利芬，惠玉芬，等.不同采血管在不同存放條件下對循環酶法同型半胱氨酸測定結果的影響［J］.檢驗醫學與臨床，2015，12（22）：3294-3296.

7毛遠麗，秦建成，李波.基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術在感染性疾病病原及耐藥檢測中的應用［J］.傳染病信息，2014，27（5）：270-273.

作者：郭菲 高靜 賈興旺 董矜 楊秋亮 顏光濤 王成彬 田亞平 王涌 單位：解放軍總醫院