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隨著棉花育種進程加快，親本遺傳基礎愈加狹窄，一些棉花新品種形態越來越相似，傳統鑒別越來越困難。目前有的參試品種存在類同性，甚至用已有品種作為新品種或以雜種F1充當常規品種參加區域試驗。隨著分子標記技術的日益成熟，在傳統的形態鑒別的基礎上，結合分子標記技術進行品種身份的識別，淘汰形態相似且DNA指紋圖譜相同的品種和與已推廣品種相似度高的品種，減少試驗與審定的重復性，能進一步提高國家棉花區試的公正性和權威性。構建品種的指紋圖譜、鑒別品種的真偽和純度，對種子產業化和品種的知識產權保護有重大意義［1］。ssr（Simplesequencerepeats）分子標記具有重復性好，操作簡單，呈共顯性等優點。本文應用SSR標記擬先構建棉花區域試驗對照種的指紋圖譜，為以后參試品種和目前生產上主推品種的指紋圖譜構建打好基礎。
1材料與方法
1．1材料
供試材料：2011年黃河流域棉花區域試驗對照種中植棉2號、魯棉研28和瑞雜816，其中中植棉2號和魯棉研28為常規品種，瑞雜816為雜交種。2011年4月27日種植于中國農業科學院棉花研究所東場試驗地。
1．2方法
1．2．1DNA提取。6月28日每個品種在田間依次選24株，每株取真葉1片，用CTAB一次抽提法［2］提取葉片總DNA。
1．2．2SSR－PCR擴增［1］。10μL反應體系：1μLDNA模板，1μL10×Buffer（含MgCl2），0．3μLdNTP（10mmol•L－1），0．2μLTaq酶（2．5U•μL－1），0．5μL正引物（10μmol•L－1），0．5μL反引物（10μmol•L－1），6．5μLddH2O。反應程序：95℃預變性1min，94℃變性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共30個循環；94℃變性1min，56℃退火45s，72℃延伸2min，4℃保存。
1．2．38％（質量濃度）聚丙烯酰胺凝膠電泳（非變性膠）［1］。將組裝好的玻璃板裝在電泳槽上，將配好的8％（質量濃度）聚丙烯酰胺凝膠倒入玻璃板內，待膠完全凝固后加入1×TBE電泳液到電泳槽內，每個孔點樣品2μL，200V電壓下電泳50min，固定8min，滲透12min，顯色后終止反應，照相并記錄結果。
1．2．4SSR標記純度檢測。利用22對核心引物進行SSR純度檢測，這些引物已應用于2007—2011年國家和省級棉花區域試驗的696個品種（系），多態性好，圖譜清晰穩定，重復性好。每株有2對以上引物的譜帶與其它植株不一致，判定為雜株，其余植株為正常株。正常株占24株的比例為SSR標記檢測的品種種子純度。
1．2．5SSR指紋圖譜的構建。經過室內純度鑒定和田間比對，每個品種取有代表性的植株2棵，用24對核心引物構建指紋圖譜。并以數字編碼表示相應引物譜帶類型記錄于表格內，相當于身份證號碼，對每個品種具有唯一性。
2結果與分析
2．1SSR標記純度的檢測結果表1表明，每個品種用22對核心引物做SSR標記純度分析，中植棉2號有2株雜株，魯棉研28無雜株，瑞雜816有3株雜株。表明魯棉研28和中植棉2號純度好，瑞雜816純度較好。從圖1看出，中植棉2號第1株和第23株為雜株。第1株為常規品種，田間表現為鈴比其它植株小；第23株為雜交種，長勢明顯較壯。魯棉研28在22對引物擴增的圖譜中沒有雜株，田間表現也整齊一致。從圖2看出，瑞雜816第1株、第10株和第13株為雜株。第1株和第10株圖譜一致為常規品種，可能是制種時遺漏未雜交授粉成功的母本花種子，莖稈茸毛較多；第13株為雜交種，明顯比正常株晚熟。通過田間比對，對DNA檢測為雜株的植株進行多次觀察，田間性狀表現與SSR標記純度檢測結果有較高的吻合度。一般情況下，常規品種SSR標記純度高于雜交棉，常規棉在多代自交下基因易純化；而雜交種制種時只要有一個親本純度較差，就會導致F1純度下降；要求2個親本純度均高，F1的純度才能保證。
2．2對照種SSR指紋圖譜的構建對SSR標記純度檢測后的3個品種進行田間比對，剔除雜株，選擇生長正常有代表性的典型植株2株，用前述提取的DNA運用24對核心引物制作指紋圖譜，圖3、圖4和圖5分別為中植棉2號、魯棉研28和瑞雜816在相同的24對引物下的指紋圖譜。
2．3身份編碼的確定24對核心引物在696個陸地棉品種中驗證，每對引物在不同的陸地棉品種間的譜帶類型基本固定，有的分為3種類型，有的分為6種類型，個別多態性好的引物能分成8種類型。分別把相應的圖譜類型轉換成編碼，用編碼來區分品種的差異，與傳統的有帶讀“1”、無帶讀“0”不同，讀法簡便，快速。表2表示3個對照種應用的24對SSR引物中，中植棉2號與魯棉研28有7對引物擴增的譜帶不同，與瑞雜816有15對引物擴增的譜帶不同；魯棉研28與瑞雜816有17對引物擴增的譜帶不同。常規品種譜帶不同的引物數量越多，表明兩品種的相似性越小，親緣關系越遠。雜交種的譜帶中呈共顯性的引物數量越多，表明2個親本親緣關系越遠，雜種優勢可能會更大。
3小結
隨著分子技術的不斷發展與完善，及國家不斷加強對種子的管理，品種的分子圖譜的構建和DNA水平上的純度檢測勢在必行。棉花與水稻、小麥等自花授粉作物不同，為常異花授粉作物，其天然雜交率在5％～20％［3］，品種的保純相對困難，對SSR標記純度要求可以適當下調。2010年國家棉花區試中常規品種（系）SSR標記純度80％以上占74．5％，SSR標記純度90％以上占67．2％；雜交種（組合）SSR標記純度80％以上占47．6％，SSR標記純度90％以上占33．8％。根據多年田間比對經驗，常規棉品種SSR標記純度在90％以上時，田間純度好；雜交種由于受2個親本的制約，SSR標記純度在80％以上視作合格。